В настоящее время доказана высокая эффективность ковалентных (необратимых) ингибиторов тромбоцитов (антиагрегантов) в предупреждении артериальных тромбозов. Ковалентные антиагреганты угнетают функции тромбоцитов посредством химической модификации молекулярных мишеней. Широкое применение в клинике находят ацетилсалициловая кислота (аспирин), реагирующая с простагландин Н2-синтазой, и тиенопиридины, продукт метаболизма которых вступает в реакцию с сульфгидрильной группой рецептора АДФ. Нами обнаружено [1], что хлорамины таурина и аминокислот обладают способностью необратимо подавлять активность тромбоцитов. Были разработаны N-ацильные и N-алкильные производные хлорамина таурина, обладающие двумя важными свойствами: повышенной устойчивостью и хемоизбирательностью [2,3].

Настоящая работа направлена на разработку антитромботической субстанции из числа хлораминовых производных аналогов аденозина (ХПА). Мы полагали, что эффективность антиагрегантного действия хлораминового соединения усилится, если вначале произойдет его специфическое связывание с мембраной тромбоцита, а затем необратимая модификация мишени. В связи с этим, привлекают внимание ХПА, поскольку тромбоциты имеют на внешней поверхности специфические рецепторы к ряду структурных аналогов аденозина [4]. Была разработана методика получения хлораминовых производных в реакции гипохлорита натрия с раствором исходных соединений [5]. Далее были изучены реакционные свойства новых хлораминов, важные для проявления их антиагрегантной активности. Определены константы скоростей реакций исследуемых ХПА с серосодержащими соединениями (метионином, цистеином, ацетилцистеином, восстановленным и окисленным глутатионом, альбумином, фибриногеном). Получено, что ХПА проявляют повышенную реакционную способность по отношению к сульфгидрильной атомной группе. Установлено, что хлорамины аналогов аденозина проявляют специфическую фармакологическую активностью как антиагреганты в трех клеточных системах. Они эффективно ингибируют агрегацию изолированных тромбоцитов, тромбоцитов в составе обогащенной тромбоцитами плазме и цельной крови при активации коллагеном или АДФ. Исследуемые хлорамины в микромолярных концентрациях вызывают угнетение функций тромбоцитов, не только ингибируя их агрегацию, но и подавляя реакцию выброса содержимого плотных гранул, а также индуцируя распад агрегатов тромбоцитов. Очевидно, что при введении ХПА в цельную кровь, они будут действовать не только на тромбоциты, но и на другие клетки крови. Для определения чувствительности эритроцитов и лейкоцитов к действию хлораминов были определены скорость гемолиза эритроцитов, и изменение скорости образования активных форм кислорода в суспензии нейтрофилов. Опыты с разбавленной суспензией эритроцитов показали, что гемолиз (наблюдаемый через 24 часа) возникает при высокой концентрации хлораминов: на один эритроцит приходится примерно 10^11 молекул. В цельной крови сильное ингибирование агрегации тромбоцитов достигается, когда это соотношение примерно на 3 порядка ниже. Установлено, что исследуемые хлорамины не вызывают существенного подавления люминол-зависимой хемилюминесценции в суспензии нейтрофилов, активированных форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА). Так, при концентрации ХПА 100 мкМ интенсивность свечения снижается примерно лишь на 15%. В присутствии ХПА также не наблюдается усиления хемилюминесценции в системе нейтрофилы – люминол без стимуляции клеток ФМА, т.е. сами хлорамины не активируют клетки. Таким образом, исследуемые хлорамины в крови действуют на тромбоциты избирательно: на уровне значительного ингибирования агрегационной активности тромбоцитов изменение свойств эритроцитов и лейкоцитов не происходит.

В работе исследовали модификацию белков системы коагуляции плазмы крови под действием ХПА. Коагуляцию инициировали тремя способами: контактным, введением тромбопластина (тканевого фактора) и введением тромбина. Оказалось, что в концентрациях, при которых происходит ингибирование агрегации тромбоцитов, исследуемые соединения не оказывают влияния на систему свертывания крови, т.е. не являются антикоагулянтами.

Антиагрегантное свойство хлораминовых аналогов аденозина, вероятно, обусловлено их способностью к модификации сульфгидрильной группы рецепторов плазматической мембраны. В действующих концентрациях аналоги хлорамина аденозина не оказывают существенного влияния на другие клетки крови.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-04-00532.



Список использованных источников

1. Murina MA, Fesenko OD, Sergienko VI, Chudina NA, Roshchupkin DI. Antithrombotic activity of N,N-dichlorotaurine on mouse model of thrombosis in vivo. Bull Exp Biol Med. 2002; 134(1): 36-8. doi: 10.1023/a:1020600520233.

2. Roshchupkina DI, Buravleva KV, Murina MA, Sergienko VI. A fluorometric study of modification of bovine serum albumin with structural analogues of taurine chloramine. Biophysics. 2017; 62 (1): 24-30. DOI: 10.1134/S0006350917010171

3. Roshchupkin DI, Sorokin VL, Semenkova GN, Buravleva KV, Murina MA. The properties of biologically significant chloramine oxidants: reactivity and its dependence on the structure of the functional atom group. Biophysics. 2019; 64, (2): 145-154. DOI: 10.1134/S000635091902015

4. Lebon G, Warne T, Edwards PC, Bennett K, Langmead CJ, Leslie AG, Tate CG. Agonist-bound adenosine A2A receptor structures reveal common features of GPCR activation. Nature. 2011; 474: 521-525. DOI:10.1038/nature10136.

5. Murina MA, Roshchupkin DI, Sergienko VI. The antiplatelet effect and chemical activity of N6-chloroadenosine phosphate. Biophysics. 2021; 66: 535-540. doi.org/10.1134/S0006350921040151.

Now, high efficacy of covalent antiplatalet agents (platelet functions inhibitors) for thrombosis prevention has been convincingly proved. Such antiplatalet agents suppress platelet functions by a chemical modification of molecular targets. Acetylsalicylic acid (aspirin) reacting with prostaglandin H2-syntase and thienopyridines whose metabolits adduct to ADP-receptor as a result of the reaction with sulfhydryl group are widely used. We found [1] that taurine and amino acid chloramines have the ability to irreversibly suppress platelet activity. N-acyl and N-alkyl derivatives of taurine chloramine have been developed, which have two important properties: increased stability and chemoselectivity [2,3].

This work is aimed at the development of an antithrombotic substance from among the chloramine derivatives of adenosine analogs (CDA). We believed that the effectiveness of the antiaggregant action of the chloraminic compound would increase if at first there is binding specifically to the platelet membrane and then undergoes irreversible modification of the target. In this regard, CDA attracts attention, since platelets have specific receptors on the outer surface for a number of structural analogues of adenosine [4]. A procedure was developed for the preparation of the interested chloraminic compounds in the reaction of sodium hypochlorite with a solution of the starting compounds [5]. Further, the reactive properties of new chloramines, which are important for the manifestation of their antiaggregant activity, were studied. The rate constants of the reactions of the studied CDA with sulfur-containing compounds (methionine, cysteine, acetylcysteine, reduced and oxidized glutathione, albumin, fibrinogen) were determined. It was found that CDA exhibit increased reactivity with respect to the sulfhydryl atomic group. It has been established that chloramines of adenosine analogues exhibit specific pharmacological activity as antiplatelet agents in three cell systems. They effectively inhibit the aggregation of isolated platelets, platelet-rich plasma and whole blood when activated by collagen or ADP. The studied chloramines in micromolar concentrations cause inhibition of platelet functions, not only inhibiting their aggregation, but also suppressing the reaction of ejection of the contents of dense granules, as well as inducing dissociation of aggregates of platelets. Obviously, when CDA is introduced into whole blood, they will act not only on platelets, but also on other blood cells. To determine the sensitivity of erythrocytes and leukocytes to the action of chloramines, the rate of hemolysis of erythrocytes and the change in the rate of formation of reactive oxygen species in a suspension of neutrophils were determined. Experiments with a dilute suspension of erythrocytes showed that hemolysis (observed after 24 hours) occurs at a high concentration of chloramines: there are approximately 10^11 molecules per erythrocyte. In whole blood, strong inhibition of platelet aggregation is achieved when this ratio is about 3 orders of magnitude lower. The studied chloramines do not cause significant suppression of luminol-dependent chemiluminescence in a suspension of neutrophils activated by phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA). Thus, at a CDA concentration of 100 μM, the luminescence intensity decreases by approximately only 15%. In the presence of CDA, there is also no increase in chemiluminescence in the system neutrophils - luminol without stimulation of PMA cells, i.e. chloramines themselves do not activate cells. Thus, chloramines in the blood act selectively on platelets: at the level of significant inhibition of platelet aggregation activity, there is no change in the properties of erythrocytes and leukocytes.

In this work, the modification of proteins of the blood plasma coagulation system under the influence of CDA was studied. Coagulation was initiated in three ways: contact, administration of thromboplastin (tissue factor) and administration of thrombin. It turned out that at concentrations at which inhibition of platelet aggregation occurs, the studied compounds do not affect the blood coagulation system, i.e. are not anticoagulants.

The antiplatelet property of chloramine analogs of adenosine is probably due to their ability to modify the sulfhydryl group of plasma membrane receptors. In active concentrations, analogues of chloramine adenosine do not affect other blood cells.

Acknowledgments. The reported study was funded by RFBR, project number 20-04-00532.

References

1. Murina MA, Fesenko OD, Sergienko VI, Chudina NA, Roshchupkin DI. Antithrombotic activity of N,N-dichlorotaurine on mouse model of thrombosis in vivo. Bull Exp Biol Med. 2002; 134(1): 36-8. doi: 10.1023/a:1020600520233.

2. Roshchupkin DI, Buravleva KV, Murina MA, Sergienko VI. A fluorometric study of modification of bovine serum albumin with structural analogues of taurine chloramine. Biophysics. 2017; 62 (1): 24-30. DOI: 10.1134/S0006350917010171

3. Roshchupkin DI, Sorokin VL, Semenkova GN, Buravleva KV, Murina MA. The properties of biologically significant chloramine oxidants: reactivity and its dependence on the structure of the functional atom group. Biophysics. 2019; 64, (2): 145-154. DOI: 10.1134/S000635091902015

4. Lebon G, Warne T, Edwards PC, Bennett K, Langmead CJ, Leslie AG, Tate CG. Agonist-bound adenosine A2A receptor structures reveal common features of GPCR activation. Nature. 2011; 474: 521-525. DOI:10.1038/nature10136.

5. Murina MA, Roshchupkin DI, Sergienko VI. The antiplatelet effect and chemical activity of N6-chloroadenosine phosphate. Biophysics. 2021; 66: 535-540. doi.org/10.1134/S0006350921040151.