Патологические воздействия, такие как ишемия или нейротравмы, снижают ацетилирование гистонов и негистоновых белков. Вероятно, это происходит в результате активации гистондеацетилаз (HDACs), что нарушает белковый синтез. Так как активация гистондеацетилаз и деацетилирование гистонов приводят к подавлению белкового синтеза, то можно рассматривать изменения экспрессии данных белков как начальные этапы патологического процесса. Но роль эпигенетических процессов в регуляции гибели и выживаемости клеток в первые часы после повреждения нервов пока не изучена.

Одна из важных экспериментальных моделей нейротравмы - перерезка седалищного нерва на бедре у грызунов, которая ведет к хроматолизу, Валлеровой дегенерации и апоптозу нейронов и глии. Перерезка седалищного нерва вызывает апоптоз глиальных клеток дорзальных ганглиев (dorsal root ganglia, DRG), удаленных на 2–3 см от места аксотомии. Пока неясно, какие первичные сигналы учувствуют в этой передачи, ведущей к выживаемости или смерти клетки?

Гистондеацетилаза HDAC3 в нейронах локализована главным образом в цитоплазме и активируется путем фосфорилирования серин/треонин киназы GSK-3β, что представляет собой механизм, который обычно активируется потерей факторов роста в сигнальном пути PI3K/Akt. Ряд работ демонстрируют ключевую нейротоксическую роль HDAC3, однако специфичность активации HDAC3 при индукции гибели нейронов до конца не изучена. Поэтому представляет интерес исследовать сигнальный путь Akt/GSK-3β, участвующий в фосфорилировании гистондеацетилазы 3 при нейротравме.

Цель работы. В настоящей работе предполагалось оценить внутриклеточную локализацию гистондеацетилазы HDAC3, а также киназ Akt/GSK-3β в нейронах и глиальных клетках DRG после перерезки седалищного нерва крыс методом иммунофлуоресцентной микроскопии путем исследования ко-локализации этих белков с ядерным маркером нейронов NeuN.

Материалы и методы. Иммунофлуоресцентную микроскопию использовали для изучения вызванных аксотомией изменений экспрессии и локализации HDAC3, а также киназ Akt/GSK-3β в ганглиях дорсальных корешков (DRG) спинного мозга крыс после перерезки седалищного нерва. Для детекции HDAC3 и киназ Akt/GSK-3β методом иммунофлуоресцентной микроскопии мы использовали анти-HDAC3 (SAB4503481 Merck, 1:250); анти-Akt (#9272 Cell Signaling, 1:250); анти-GSK3-3β (#9315 Cell Signaling, 1:250); антитело против фосфо-GSK-3β (Ser9) (клеточная сигнализация #9323, 1:250) и антитело против NeuN (MAB377 Merck, 1:1000). Ядра всех нейронов и глиальных клеток визуализировали с помощью Hoechst 33342 (Cat. № 14533). Совместную локализацию белка-мишени с маркером нейрона NeuN оценивали с помощью программы ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/) с помощью плагина JaCoP. Коэффициент совместной локализации M1 отражает долю пикселей в зеленых каналах (белок-мишень) относительно общего сигнала, зарегистрированного в красном канале (маркер нейрона NeuN). В расчетах было использовано не менее 100 клеток. Для количественной оценки среднего уровня флуоресценции E2F1 в экспериментальных и контрольных образцах DRG использовали 10 контрольных и 10 экспериментальных изображений для каждой из 7 крыс. Оценивали среднюю (по площади) флуоресценцию цитоплазмы и ядра для каждой клетки и полученные значения усредняли. Образцы DRG крыс фотографировали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus BX-51, оснащенного цифровой камерой OrcaFlash 4.0 V3 (Hamamatsu, Япония) при длинах волн возбуждения приблизительно 535 нм для анти-мышиного IgG1 (γ1), меченного CF555, 488 нм для анти-кроличьего IgG (H+L), меченного CF488A и 365 нм для Hoechst-33342. Флуоресценцию регистрировали при длинах волн >580 нм и >460 нм соответственно. Уровень белка анализировали по интенсивности флуоресценции с использованием программного обеспечения ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/, доступ на 4 декабря 2022 года).

Результаты. Метод двойного иммунофлуоресцентного окрашивания показал, что уровень HDAC3 в цитоплазме поврежденных DRG значительно сверхэкспрессируется уже через 1 час после аксотомии (p<0,01), но снижается через 4 часа по сравнению с контрольными ганглиями (p<0,05) и уровнем, определяемым через 1 час (p<0,01). Через 24 часа после повреждения разницы не наблюдалось. В ядре аксотомированных DRG уровень HDAC3 увеличивался через 4 часа после перерезки седалищного нерва по сравнению с неповрежденными ганглиями крыс (p<0,01), но не через 1 или 24 часа. Это свидетельствует о перераспределении HDAC3 из цитоплазмы в ядро через 4 часа после аксотомии седалищного нерва крысы, что также подтверждается коэффициентом М1 ( р<0,05). Согласно полученным данным, аксотомия седалищного нерва крыс вызывала достоверное снижение уровня Akt через 24 часа в цитоплазме клеток ганглиев (в 2 раза относительно контрольных ганглиев (р <0,01) и в 1,5 раза относительно четырехчасовой группы (р <0,01). Уровень Act в ядре при этом не изменялся и был низким. Уровень GSK3бета был низким и не изменялся на всем протяжении исследования, как в ядре, так и цитоплазме нейронов спинномозговых ганглиев крыс. Однако, по данным иммунофлуоресцентного анализа уровень phospho-GSK-3β (Ser9) достоверно увеличивался через 24 часа в цитоплазме клеток аксотомированных спинномозговых ганглиях крыс (р <0,01).

Таким образом, наши данные свидетельствуют о вовлеченности HDAC3, а также сигнального пути Akt/GSK3бета в вызванное аксотомией повреждение нейронов и глиальных клеток DRG. Метод двойного иммунофлуоресцентного окрашивания показал, что перерезка седалищного нерва вызывает транслокацию HDAC3 из цитоплазмы в ядро в первые 24 часа после аксотомии. Антитело Akt #9272 подтверждает подавление экспрессии белка в DRG спинного мозга крыс после перерезки седалищного нерва. Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием антитела к фосфо-GSK-3β (Ser9) #9323 указывают на активацию нисходящего пути при сниженной экспрессии самого Akt.

Работа выполнена при финансовой поддержке стипендии Президента Российской Федерации для молодых ученых.

Pathological conditions, like ischemia or neurotrauma, decrease acetylation of histones and nonhistone proteins. This is probably due to the activation of histone deacetylases (HDACs), which disrupts protein synthesis. Since the activation of histone deacetylases and histone deacetylation result in the suppression of protein synthesis, the changes in the expression of these proteins can be considered the initial stages of the pathological process. However, the role of epigenetic processes in the regulation of cell death and survival in the first hours after nerve damage has not yet been studied.

One important experimental model of neurotrauma is the sciatic nerve transection in rodents, which leads to Wallerian degeneration of axons and death of neurons and glial cells. Sciatic nerve transection induces apoptosis of glial cells of the dorsal root ganglia (DRG) 2-3 cm away from the axotomy site. It is still unclear what primary signals are involved in the transmission of signals from the lesion site to the remote ganglion, resulting in cell survival or death.

In neurons, histone deacetylase HDAC3 is localized mainly in the cytoplasm and is activated via phosphorylation of the serine/threonine kinase GSK-3β, which is a mechanism that is normally activated by growth factor loss in PI3K/Akt signaling pathway. A number of works demonstrate a key neurotoxic role of HDAC3, but the specificity of HDAC3 activation in the induction of neuronal death is not fully understood. Therefore, it is of interest to investigate the Akt/GSK-3β signaling pathway involved in the phosphorylation of histone deacetylase 3 upon neurotrauma.

Work objective. To evaluate the intracellular localization of HDAC3 and Akt/GSK-3β kinases in neurons and glial DRG cells after sciatic nerve transection in rats using immunofluorescence microscopy study of co-localization of these proteins with the neuronal nuclear marker NeuN.

Materials and methods. Immunofluorescence microscopy was used to study axotomy-induced changes in the expression and localization of HDAC3 and Akt/GSK-3β kinases in rat DRG after sciatic nerve transection. For the detection of HDAC3 and kinases Akt/GSK-3β via immunofluorescence microscopy we used the anti-HDAC3 (SAB4503481 Merck, 1:250); anti-Akt (#9272 Cell Signaling, 1:250); anti-GSK3-3β (#9315 Cell Signaling, 1:250); anti-phospho-GSK-3β (Ser9) (#9323 Cell Signaling, 1:250) and anti-NeuN (MAB377 Merck, 1:1000) antibodies. The nuclei of all neurons and glial cells were images with Hoechst 33342 (Cat. No 14533). Co-localization of a target protein with the NeuN neuron marker was evaluated using the ImageJ application with the JACoP plugin. The co-localization coefficient M1 represents the ratio of pixels in the green channels (target protein) to the total signal recorded in the red channel (NeuN neuron marker). At least 100 cells per slice were used in the calculations. To calculate the mean level of fluorescence in experimental and control DRG samples, 10 control, and 10 experimental images were used for each of the 7 rats. The area-mean fluorescence of the cytoplasm and nucleus for each cell was estimated and the obtained values were averaged. The rat DRG samples were photographed using an Olympus BX-51 fluorescent microscope equipped with OrcaFlash 4.0 V3 digital camera (Hamamatsu, Japan) at approximately 535 nm excitation wavelengths for Anti-Mouse IgG1 (γ1) labeled with CF555, 488 nm for anti-rabbit IgG (H+L) labeled with CF488A, and 365 nm for Hoechst-33342. Antibody fluorescence was recorded at wavelengths >580 nm and >460 nm, respectively. Protein level was estimated by fluorescence intensity in the ImageJ application (http://rsb.info.nih.gov/ij/, accessed on December 4, 2022)..

Results. The double immunofluorescent staining has shown that the level of HDAC3 in the cytoplasm of damaged DRGs was significantly overexpressed one hour after axotomy (p<0.01), but decreased in four hours agaist the control ganglia (p<0.05) and the level detected one hour later (p<0.01). No difference was observed 24 hours after the injury. In the nucleus of axotomized DRGs, HDAC3 levels increased in four hours after the transection compared to intact rat ganglia (p<0.01), but not in one or 24 hours. This indicates a redistribution of HDAC3 from the cytoplasm to the nucleus 4 hours after axotomy, which is also confirmed by the M1 coefficient ( p<0.05). According to the data obtained, the axotomy caused a significant decrease in the Akt level in 24 hours in the cytoplasm of the ganglion cells twofold relative to the control ganglion cells (p<0.01) and 1.5-fold relative to the four-hour group ( p<0.01). Akt level in the nucleus was unchanged and low. GSK3beta level was low and did not change throughout the study, both in the nucleus and cytoplasm of neurons of rat the ganglia. However, according to immunofluorescence analysis, the level of phospho-GSK-3β (Ser9) was significantly increased in 24 hours in the cell cytoplasm of axotomized ganglia (p<0.01).

Thus, our data indicate the involvement of HDAC3 and Akt/GSK3beta signaling pathway in axotomy-induced damage to neuronal and glial DRG cells. The double immunofluorescence staining has shown that sciatic nerve transection causes HDAC3 translocation from the cytoplasm to the nucleus in the first 24 hours after axotomy. The Akt antibody #9272 confirms silencing of protein expression in DRG of the rat spinal cord after sciatic nerve transection. The phospho-GSK-3β (Ser9) antibody #9323 was used to confirm downstream pathway activation with reduced Akt expression..

This work was supported by a Presidential Fellowship for Young Scientists of the Russian Federation.