На данный момент для лечения ВИЧ-инфекции применяется высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ), в основе которой лежит применение классических препаратов – нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (НИОТ), проявляющих высокую эффективность в подавлении репликации ВИЧ и препятствующих дальнейшему прогрессированию заболевания. Известно, что основными недостатками большинства применяемых препаратов является высокая токсичность и низкая биодоступность [1-2]. Все это негативно сказывается при продолжительном приеме препаратов, приводя к серьезным побочным эффектам и возникновению резистентных вирусных штаммов. Таким образом, снижение эффективности анти-ВИЧ-терапии, делает необходимой и важной задачей модификацию ингибиторов обратной транскриптазы, что позволит устранить большинство ограничений данных препаратов.

Поэтому чрезвычайно актуальным является применение многоцелевого пролекарственного подхода, позволяющего разработать препараты с улучшенными характеристиками, что сведет к минимуму вышеперечисленные недостатки. Пролекарственный подход, включающий в себя использование веществ липидной природы, в частности 1,3-диацилглицеринов, способствует тому, что нуклеозидный препарат будет включаться в метаболизм липидов и тем самым направленно достигать лимфатической системы (резервуара ВИЧ), всасываясь вместе с жирами в тонком кишечнике, таким образом, обходя первичную деградацию в печени [3].

Поэтому целью данной работы является получение и исследование свойств конъюгатов 3`-азидо-3`-дезокситимидина (AZT) и 2’,3’-дидезокси-3’-тиацитидина (3ТС) и производных 1,3-дипальмитоилглицерина, модифицированных по фосфорному центру эфирами L-аланина.

По известным методикам [4] были получены глицеролипидные производные 3`-азидо-3`-дезокситимидина и 2’,3’-дидезокси-3’-тиацитидина, в которых связывание молекулярных фрагментов осуществлялось с помощью функциональных фосфорных связей. Известно, что амидофосфатные производные нуклеозидных препаратов представляют больший интерес, так как многие из них проявляют высокую противовирусную активность и повышенную устойчивость к химическому и ферментативному гидролизу. С целью повышения стабильности полученных конъюгатов AZT и 3TC к действию гидролиза в различных биологических средах, а также модулирования ингибирующей активности таких соединений осуществляли разработку их амидофосфатных производных с эфирами аминокислот [5].

Были проведены исследования кинетики гидролиза полученных соединений в различных буферных растворах, моделирующих рН физиологических сред. Было обнаружено, что время половинного гидролиза данных веществ более 20 ч. При изучении ферментативного гидролиза данных пролекарств in vitro под действием панкреатической липазы свиньи время половинного гидролиза составило 0.5 мин. Это может позволить имитировать природные аналоги таких глицеролипидных соединений.

Исследование цитотоксичности соединений на клеточной линии МТ-4 показало, что большинство конъюгатов являются малотоксичными (СС50 >100 мкМ). Результаты определения антивирусной активности соединений в инфицированных ВИЧ-1 клетках МТ-4 свидетельствуют о том, что среди конъюгатов AZT наиболее активным оказалось производное, содержащее остаток этилового эфира L-аланина (ЕС50 0.012 мкМ). В ряду производных 3ТС наибольшую ингибирующую активность проявило соединение, содержащие трет-бутиловый эфир L-аланина (EC50 25.46 мкМ).

Изучение биологической активности полученных глицеролипидных производных AZT и 3ТС показало, что часть соединений имеет преимущества (низкая токсичность, высокий уровень анти-ВИЧ-активности) по сравнению с исходными нуклеозидами, что делает возможным использование данных пролекарств с целью расширения арсенала препаратов, входящих в схемы антиретровирусной терапии.

Литература

1. Lakshmi N.R., Appakkudal Anand R. Targeting strategies for delivery of anti-HIV drug//J. Controlled Release.2014. V.192. p.271–283

2. Gu S., Zhu Y., Wang C., Wang H., Liu G., Cao S., Huang L. Recent discoveries in HIV-1 reverse transcriptase inhibitors. Curr. Opin. Pharmacol. 2020. V. 54. P. 166-172

3. Lambert D.M. Rationale and applications of lipids as prodrug carriers. // Eur. J. Pharm. Sci. –2000. –V. 11 (Suppl. 2), –P. S15–S27.

4. Shastina N.S., Maltseva T. Yu., D’yakova L.N., et al. Synthesis, properties, and anti-HIV activity of new lipophilic 3'-azido-3'-deoxythymidine conjugates containing functional phosphoric linkages. // Russ. J. Bioorg. Chem. –2013. –V. 39, № 2. –P. 161-169 (in Russ.).

5. Darnotuk E.S., Siniavin A.E., Shulga N.V., et al. Phosphoramidate conjugates of 3’-azido-3’-deoxythymidine glycerolipid derivatives and amino acid esters: synthesis and anti-HIV activity. // Med.Chem.Res. –2021. –V. 30, –P. 664-671.

Currently, highly active antiretroviral therapy (HAART) is used for the treatment of HIV infection, which is based on the use of classical drugs based on nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTI), which are highly effective in suppressing HIV replication and preventing further progression of the disease. It is known that the main disadvantages of most of the drugs used are high toxicity and low bioavailability [1-2]. All this negatively affects during the prolonged use of drugs, leading to serious side effects and the emergence of resistant viral strains. Thus, the decrease in the effectiveness of anti HIV therapy makes it necessary and important to modify reverse transcriptase inhibitors, which will eliminate most of the existing shortcomings of these drugs.

Therefore, it is extremely relevant to use a multi-purpose prodrug approach that allows the development of drugs with improved characteristics, which will minimize the above disadvantages. The prodrug approach, which includes the use of substances of a lipid nature, in particular 1,3-diacylglycerols, contributes to the fact that the nucleoside drug will be included in lipid metabolism and thereby directionally reach the lymphatic system (HIV reservoir), absorbed together with fats in the small intestine, thus bypassing primary degradation in the liver [3].

Therefore, the purpose of this work is to obtain and study the properties of conjugates of 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT) and 2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine (3TC) and derivatives of 1,3-dipalmitoylglycerol modified by phosphorus center with L-alanine esters.

Glycerolipid derivatives of 3'-azido-3'-deoxythymidine and 2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine were obtained by known methods [4], in which the binding of molecular fragments was carried out using functional phosphorus bonds. It is known that phosphoramidate derivatives of nucleoside preparations are of greater interest, since many of them exhibit high antiviral activity and increased resistance to chemical and enzymatic hydrolysis. In order to increase the stability of the resulting AZT and 3TC conjugates to the action of hydrolysis in various biological media, as well as to modulate the inhibitory activity of such compounds, their phosphoramidate derivatives with amino acid esters were developed [5].

We have conducted studies the kinetics hydrolysis of synthesized compounds in various buffer solutions that simulate the pH of physiological media. We have established that the hydrolysis half-time for these molecules exceeded 20 h. When investigating the enzymatic hydrolysis of these prodrugs by the porcine pancreatic lipase in vitro, the hydrolysis half-time was 30 s. This can mimic the metabolic pathways of natural glycerolipid compounds.

The study of the cytotoxicity of the compounds on the MT-4 cell line showed that most of the conjugates have of low toxicity (CC50 >100 μM). The results of determining the antiviral activity of a compounds in HIV-1 infected MT-4 cells showed that among of AZT conjugates, the derivative containing the L-alanine ethyl ester residue (EC50 0.012 μM) turned out to be the most active. And among the 3TC derivatives, the compound containing L-alanine tert-butyl ester (EC50 25.46 μM) showed the highest inhibitory activity.

The study of the biological activity of the obtained glycerolipid derivatives of AZT and 3TC showed that some of the compounds have advantages (low toxicity, high level of anti-HIV activity) compared to the original nucleosides, which makes it possible to use these prodrugs to expand the arsenal of drugs included in antiretroviral therapy regimens.

References:

1. Lakshmi N.R., Appakkudal Anand R. Targeting strategies for delivery of anti-HIV drug//J. Controlled Release.2014. V.192. p.271–283

2. Gu S., Zhu Y., Wang C., Wang H., Liu G., Cao S., Huang L. Recent discoveries in HIV-1 reverse transcriptase inhibitors. Curr. Opin. Pharmacol. 2020. V. 54. P. 166-172

3. Lambert D.M. Rationale and applications of lipids as prodrug carriers. // Eur. J. Pharm. Sci. –2000. –V. 11 (Suppl. 2), –P. S15–S27.

4. Shastina N.S., Maltseva T. Yu., D’yakova L.N., et al. Synthesis, properties, and anti-HIV activity of new lipophilic 3'-azido-3'-deoxythymidine conjugates containing functional phosphoric linkages. // Russ. J. Bioorg. Chem. –2013. –V. 39, № 2. –P. 161-169 (in Russ.).

5. Darnotuk E.S., Siniavin A.E., Shulga N.V., et al. Phosphoramidate conjugates of 3’-azido-3’-deoxythymidine glycerolipid derivatives and amino acid esters: synthesis and anti-HIV activity. // Med.Chem.Res. –2021. –V. 30, –P. 664-671.