Визуализация нейрональной активности определённой области головного мозга свободно передвигающегося животного in vivo позволяет получить обширный массив информации о паттернах работы нейронов, изменении в их возбудимости и взаимосвязи между друг другом [1]. Методом, который позволяет регистрировать активность отдельных групп нейронов у мыши, находящейся в свободном движении, является миниатюрная флуоресцентная микроскопия – минископ [2]. При массе микроскопа в 3 грамма минископ обладает разрешением, достаточным для визуализации отдельных нейронов, что позволяет детектировать изменения в работе нейронов при помощи экспрессии в них генетически кодируемых кальциевых индикаторов – GСaMP6f.

В данном исследовании инъекция вируса AAV1-Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 была выполнена в гиппокамп (AP -2.1, ML +2.1, DV -1.8) 5-месячных мышей линии B6SJL, и через 3 недели над областью интереса фиксировалась градиентная линза, которая является оптических путем для минископа. Далее осуществлялась имплантация опорной площадки, на которую в последствии фиксировался минископ для визуализации кальциевой динамики нейронов гиппокампа. Аккомодация к миниатюрному флуоресцентному минископу Miniscope v3 проводилась в экспериментальных условиях теста «открытое поле» в течении 3 дней. Для перехода от качественного анализа данных о нейрональной активности, полученных методом минископ, был разработан программный пакет на языке Python, который дает возможность исследователям количественно оценить данные, за счет вычисления статистических данных о нейронной сети, в данном случае гиппокампа. На начальном этапе определяется активное состояние нейрона, поиск промежутков, когда внутриклеточная концентрация кальция увеличивается, что приводит к увеличению интенсивности кальциевого индикатора GСaMP6f. Активное состояние нейрона определяется, опираясь на производные входных сигналов после первичной обработки посредством программного продукта Minian. Нейрон находится в активном состоянии, если производная его сигнала превышает пороговое значение, которые высчитывается по данной формуле: 𝒕𝒉𝒓𝒆𝒔𝒉𝒐𝒍𝒅=𝒎𝒆𝒅𝒊𝒂𝒏(𝒙)+𝒎𝒂𝒅(𝒙), где 𝑥 – значения производной сигнала, 𝑚𝑎𝑑 – среднее абсолютное отклонение. Далее производится вычисление статистик, описывающих поведение нейронной сети: уровень активности нейронной сети –количество активных нейронов за определенный промежуток времени; расчет попарных корреляций между нейронами с вычислением коэффициента Пирсона; всплесковая активность нейронов - количество «активаций клетки» за установленный промежуток времени. По полученным распределениям значений корреляции вычисляется связность – доля связанных нейронов в зависимости от порогового уровня. Также реализован модуль оценки зависимости коэффициента корреляции между нейронами от расстояния между ними.

На следующем этапе, был реализован модуль перемешивания. Этот модуль необходим для определения закономерности полученных статистик (они имеют биологическую/ физиологическую природу) или же они являются случайными величинами. При сравнении значений статистик, полученных на исходных данных, а также перемешанных, наблюдается уменьшение среднего значения каждой из представленных статистик для каждого из дней регистрации минископом. Это, вероятно, связано с тем, что при перемешивании данных происходит утеря информации о связях между нейронами, которая обуславливает исходные значения статистик. На основе этих данных можно предположить, что регистрируемое изменение внутриклеточной концентрации кальция, которое коррелирует с изменениями возбудимости нейронов, и статистики, вычисленные на основе анализа кальциевых сигналов, являются биологически значимыми, определяющими функционирование нейронной сети гиппокампа.

Данный подход к изучению работы нейронных сетей головного мозга, в частности гиппокампа, позволит определить и зарегистрировать нарушения в их работе, при патологических состояниях головного мозга в неврологических и нейродегенеративных заболеваниях, в том числе и при болезни Альцгеймера.

Работа была поддержана программой стратегического академического лидерства “Приоритет 2030” Российской Федерации (Соглашение 75-15-2021-1333 от 30.09.2021 с СПбПУ).

1. Lütcke H. Steady or changing? Long-term monitoring of neuronal population activity / H. Lütcke, D.J. Margolis, F. Helmchen // Trends in Neurosciences. – 2013. – Vol. 36. – № 7. – P. 375-384.

2. Miniature fluorescent microscope: History, application, and data processing / E.I. Gerasimov [et al.] // Zhurnal Vysshei Nervnoi Deyatelnosti Imeni I.P. Pavlova. – 2020. – Vol. 70. – № 6. – P. 852-864.

Visualization of the neuronal activity of a certain area of the brain of a freely behaving animal in vivo allows researchers to obtain an extensive array of information about the patterns of neuronal activity, changes in their excitability and the relationship between each other [1]. A method that allows recording the activity of individual groups of neurons in a mouse in free movement is a miniature fluorescence microscopy – a miniscope [2]. With a microscope weight of 3 grams, the miniscope has a resolution sufficient to visualize individual neurons, which makes it possible to detect changes in the work of neurons using the expression of genetically encoded calcium indicators in them – GCaMP6f.

In this study, the injection of the AAV-Syn-GCaMP6f virus was performed in the hippocampus (AP -2.1, ML +2.1, DV -1.8) of 5-month-old B6SJL mice, and after 3 weeks a GRIN-lens was fixed over the area of interest, which is the optical path for the miniscope. Next, a baseplate was implanted, on which a miniscope was subsequently fixed to visualize the calcium dynamics of hippocampal neurons. Accommodation to a miniature fluorescent Miniscope v3 was carried out under experimental conditions of the "open field" test for 3 days. To move from qualitative analysis of the data on neuronal activity obtained by the miniscope, a software package in Python was developed, which allows researchers to quantify the data by calculating statistical data on the neural network, in this study - the hippocampus. At the initial stage, the active state of the neuron is determined, the search for gaps when the intracellular calcium concentration increases, which leads to an increase in the intensity of the calcium indicator GCaMP6f. The active state of a neuron is determined based on the derivatives of input signals after primary processing by means of the Minian software product. A neuron is in an active state if the derivative of its signal exceeds the threshold value, which is calculated using this formula: 𝒕𝒉𝒓𝒆𝒔𝒉𝒐𝒍𝒅=𝒎𝒆𝒅𝒊𝒂𝒏(𝒙)+𝒎𝒂𝒅(𝒙), where 𝑥 are the values of the derivative of the signal, 𝑚𝑎𝑑 is the average absolute deviation. Next, statistics describing the neural network are calculated: the activity level of the neural network is the number of active neurons for a certain period of time; calculation of pairwise correlations between neurons with calculation of the Pearson coefficient; burst activity of neurons - the number of "cell activations" over a set period of time. According to the obtained distributions of correlation values, connectivity is calculated – the proportion of “connected” neurons depending on the threshold level. A module for estimating the dependence of the correlation coefficient between neurons on the distance between them is also implemented.

At the next step, the shuffling module was created. This module is necessary to determine the regularity of the statistics obtained (they have a biological/ physiological nature) or they are random variables. When comparing the values of statistics obtained from the initial data, as well as shuffled, there is a decrease in the average value of each of the presented statistics for each of the days of registration. This is probably due to the fact that when shuffling data, information about the connections between neurons is lost, which determines the initial values of statistics. Based on these data, it can be assumed that the recorded change in intracellular calcium concentration, which correlates with changes in the excitability of neurons, and statistics calculated based on the analysis of calcium signals, are biologically significant, determining the functioning of the hippocampal neural network.

This approach to studying the work of neural networks of the brain, in particular the hippocampus, will allow to identify and determine violations in their work in pathological conditions of the brain in neurological and neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease.

The work was supported by the strategic academic leadership program “Priority 2030” of the Russian Federation.

1. Lütcke H. Steady or changing? Long-term monitoring of neuronal population activity / H. Lütcke, D.J. Margolis, F. Helmchen // Trends in Neurosciences. – 2013. – Vol. 36. – № 7. – P. 375-384.

2. Miniature fluorescent microscope: History, application, and data processing / E.I. Gerasimov [et al.] // Zhurnal Vysshei Nervnoi Deyatelnosti Imeni I.P. Pavlova. – 2020. – Vol. 70. – № 6. – P. 852-864.