Редокс-состояние клеток тесно связано с активностью дыхательной цепи (электронтранспортной цепи, ЭТЦ) митохондрий. Регуляция работы дыхательной цепи митохондрий важна для обеспечения клеток АТФ, а также для оптимизации количества супероксид-анион радикала, образующегося в ЭТЦ. Генерация супероксид-анион радикала с последующим образованием других активных форм кислорода может использоваться в сигнальных процессах или приводить к развитию окислительного стресса. Цитохром С – важный компонент ЭТЦ, осуществляющий перенос электрона между комплексами III и IV в межмембранном пространстве митохондрий. При определенных условиях цитохром С может выходить из митохондрий и инициировать апоптоз. Несмотря на многочисленные исследования митохондрий остается неизвестным, существуют ли механизмы регуляции активности цитохрома С, влияющие на его конформацию и электрон-транспортные свойства.

Мы разработали новый методический подход, основанный на спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР, surface-enhanced Raman spectroscopy SERS) c использованием серебряных плазмонных наноструктур, позволяющий исследовать конформацию гема цитохрома С в интактных функционирующих митохондриях. Мы установили, что спектры ГКР, регистрируемые от изолированных митохондрий кардиомиоцитов, представляют собой набор пиков, характерных для колебаний атомов в пиррольных кольцах и метиновых мостиков гема окисленного цитохрома С и зависящих от конформации гема. Мы показали, что при работе ЭТЦ гем цитохрома С обратимо изменяет конформацию между плоской и искаженной, при этом деполяризация внутренней митохондриальной мембраны и уменьшение концентрации протонов в межмембранном пространстве увеличивают вероятность реализации плоской конформации гема, а гиперполяризация внутренней митохондриальной мембраны и увеличение концентрации протонов уменьшают вероятность плоской конформации. Известно, что для переноса электрона между цитохромом С1 и цитохромом С необходима правильная ориентация гемов друг относительно друга, при этом в случае цитохрома С оптимальной является плоская конформация гема. Мы предполагаем, что деполяризация внутренней мембраны митохондрий, происходящая при активном синтезе АТФ в АТФ-синтазе при увеличении клеточной активности, приводит к переходу гема цитохрома С в плоскую конформацию и ускорению переноса электрона между комплексом III и цитохромом С, увеличивая активность всей ЭТЦ и способствуя синтезу АТФ. Мы установили, что при гипертонии в изолированных митохондриях кардиомиоцитов потенциал на внутренней митохондриальной мембране не влияет на конформацию гема цитохрома С, что может приводить к ухудшению регуляции активности электронного транспорта. Мы полагаем, что предложенный подход к изучению цитохрома С в митохондриях может быть перспективным методом исследования механизмов регуляции свойств цитохрома С в интактных митохондриях.

The redox state of cells is closely related to the activity of the respiratory chain (electron transport chain, ETC) of mitochondria. Regulation of the mitochondrial respiratory chain is important for providing cells with ATP, as well as for optimizing the amount of superoxide anion radical formed in the ETC. The generation of the superoxide anion radical followed by the formation of other reactive oxygen species can be used in signaling processes or can lead to the development of oxidative stress. Cytochrome C is an important component of the ETC, which carries electron between complexes III and IV in the intermembrane space of mitochondria. Under certain conditions, cytochrome C can exit mitochondria and initiate apoptosis. Despite numerous studies of mitochondria, it remains unknown whether there are mechanisms of regulation of cytochrome C activity that affect its conformation and electron transport properties.

We have developed a new methodological approach based on surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) with the use of silver plasmonic nanostructures, which makes it possible to study the cytochrome C heme conformation in intact functioning mitochondria. We found that the SERS spectra recorded from isolated mitochondria of cardiomyocytes represent a set of peaks characteristic of atomic vibrations in the pyrrole rings and methine bridges of the heme of oxidized cytochrome C and depend on the conformation of the heme. We have shown that cytochrome C heme reversibly changes its conformation between planar and ruffled forms during ETC activity, while depolarization of the inner mitochondrial membrane and the decrease in the concentration of protons in the intermembrane space increase the probability of the planar heme conformation, while hyperpolarization of the inner mitochondrial membrane and the increase in proton concentration decrease the probability of planar conformation. It is known that for the transfer of an electron between cytochrome C1 and cytochrome C, the correct orientation of the hemes relative to each other is necessary, while in the case of cytochrome C, the planar conformation of the heme is optimal. We assume that the depolarization of the inner mitochondrial membrane, which occurs during the active synthesis of ATP in ATP synthase with an increase in cellular activity, the cytochrome C heme acquires the planar conformation that accelerates the electron transfer between complex III and cytochrome C, increasing the activity of the entire ETC and promoting the synthesis ATP. We found that under hypertension in isolated mitochondria of cardiomyocytes the potential on the inner mitochondrial membrane does not affect the cytochrome C heme conformation, which can lead to a deterioration in the regulation of electron transport activity. We believe that the proposed approach to the study of cytochrome C in mitochondria can be a promising tool for studying the mechanisms of regulation of cytochrome C properties in intact mitochondria.