Наиболее значимым из всех метаболических заболеваний является сахарный диабет второго типа (СД2). Отсутствие или неадекватная сахароснижающая терапия в сочетании с нарушением режима питания и другими факторами ведёт к развитию гипергликемии, при которой уровень глюкозы в крови может достигать 10-12 мМ. СД2 и сопутствующая ему гипергликемия вызывают развитие целого ряда осложнений, снижающих качество жизни, например, диабетической ретинопатии, полинейропатии или диабетической стопы. Клеточная составляющая иммунного ответа в наибольшей степени обусловлена нейтрофилами, обеспечивающими врождённый иммунитет, реализующий множество защитных и сигнальных функций. Нейтрофилы мигрируют в очаг воспаления, где активируются, высвобождая путем дегрануляции или нетоза содержимое цитоплазматических гранул, в результате чего, во внеклеточную среду попадают различные биологически активные молекулы, в частности миелопероксидаза (МПО). МПО катализирует образование активных форм галогенов (АФГ), выполняющих бактерицидную функцию, но их чрезмерная продукция приводит к повреждению молекул, клеток и тканей организма, что вызывает формирование галогенирующего стресса [1]. Последний становится причиной развития сердечно-сосудистых, метаболических, нейродегенеративных и других заболеваний. В этой связи актуальным является поиск средств и подходов, позволяющих регулировать уровень МПО в крови и препятствовать развитию галогенирующего стресса. На эту роль могут претендовать лактоферрин (ЛФ) и витамин D3. ЛФ широко распространён во всех секреторных жидкостях организма, а также, локализован в специфических гранулах нейтрофилов, проявляет иммуномодулирующую, антимикробную, антиокислительную и другие биологически важные функции [2]. Витамин D3 и его метаболиты обладают противовоспалительными, антиокислительными свойствами, препятствуют нетозу [3].

Цель работы – изучение влияния ЛФ и витамина D3 на содержание в крови здоровых доноров и больных СД2 МПО, маркеров галогенирующего стресса и нетоза при индуцированной активации нейтрофилов в экспериментах ex vivo.

Материалы и методы. В исследовании участвовало 15 человек различного пола, в возрасте от 45 до 86 лет, среди которых было 8 здоровых доноров и 7 пациентов, страдающих СД2 со стойкой гипергликемией (уровень глюкозы в крови превышал 7 мМ, уровень гликированного гемоглобина 7-9%). Забор венозной крови производили в вакуумные пробирки с ЭДТА. ЛФ и витамин D3 добавляли в кровь соответственно до концентрации 1 мг/мл и 5 нг/мл и инкубировали 2 часа при 37°С, после чего нейтрофилы активировали добавлением форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА, 0,16 мкМ), инкубировали еще 0,5 часа. Далее в плазме методом ИФА определяли содержание МПО, маркеров галогенирующего стресса: хлорированных альбумина (ЧСА-Cl), церулоплазмина (ЦП-Cl), липопротеинов низкой плотности (ЛНП-Cl), а также комплекса ДНК-МПО – маркера нетоз [4].

Результаты. ИФА исследование показало, что добавление в кровь активатора нейтрофилов – ФМА приводило к значительному возрастанию уровня МПО, маркеров галогенирующего стресса (ЧСА-Cl, ЦП-Cl, ЛНП-Cl) и нетоза (ДНК-МПО), как у доноров, так и у больных СД2. Преинкубация крови с ЛФ достоверно снижала все измеряемые параметры на 40-90% по сравнению с контролем. Инкубация крови с витамином D3 достоверно снизила уровень ДНК-МПО, наблюдалась тенденция к снижению МПО. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ЛФ и витамин D3 способны снижать секрецию нейтрофилами МПО и препятствовать нетозу. В добавок к этому, ЛФ, воздействуя на активированные нейтрофилы, тормозил развитие галогенирующего стресса.

Наши результаты позволяют предположить, что ЛФ способен транслоцироваться в мембрану, затрудняя выход из клетки нейтрофильных внеклеточных ловушек, в состав которых входит МПО. Это должно способствовать уменьшению концентрации фермента в плазме и, как следствие, снижению маркеров галогенирующего стресса. Падение уровня ЛНП-Cl в крови можно объяснить способностью ЛФ конкурировать с МПО за связывание с поверхностью ЛНП. Вытесняя функционирующую МПО из комплекса ЛНП-МПО, ЛФ препятствует модификации ЛНП под действием АФГ, образующихся при МПО-катализе [5]. Витамин D3 способен снижать уровень маркеров нетоза, что согласуется с полученными ранее данными [3].

Полученные результаты расширяют возможность использования ЛФ и витамина D3 в качестве основы для создания новых средств и подходов, направленных на регуляцию и коррекцию функции нейтрофилов и МПО с целью предотвращения галогенирующего стресса, что должно иметь положительный эффект при заживлении ран и течении хронических воспалительных заболеваний.

Работа поддержана грантом РНФ (20-15-00390).



Литература

1. Panasenko O.M., Torkhovskaya T.I., Gorudko I.V., Sokolov A.V. The role of halogenative stress in atherogenic modification of low-density lipoproteins. Biochemistry (Moscow). 2020. V. 85. Suppl. 1. P. S34-S55.

2. Терехова М.С., Горудко И.В., Григорьева Д.В., Семак И.В., Соколов А.В., Панасенко О.М., Черенкевич С.Н. Железосвязывающая способность лактоферрина при воспалении. Докл. БГУИР. 2018. №7(117). С. 80-84.

3. Basyreva L.Yu., Vakhrusheva T.V., Letkeman Z.V., Maximov D.I., Fedorova E.A., Panasenko O.M., Ostrovsky E.M., Gusev S.A. Effect of vitamin D3 in combination with omega-3 polyunsaturated fatty acids on NETosis in type 2 diabetes mellitus patients. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021. Article ID 8089696.

4. Соколов А.В., Костевич В.А., Горбунов Н.П., Григорьева Д.В., Горудко И.В., Васильев В.Б., Панасенко О.М. Связь между активной миелопероксидазой и хлорированным церулоплазмином в плазме крови пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Медицинская иммунология. 2018. Т. 20. С. 699-710.

5. Vasilyev V.B., Sokolov A.V., Kostevich V.A., Elizarova A.Y., Gorbunov N.P., Panasenko O.M. Binding of lactoferrin to the surface of low-density lipoproteins modified by myeloperoxidase prevents intracellular cholesterol accumulation by human blood monocytes. Biochem. Cell. Biol. 2021. V. 99. P. 109-116.

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a serious metabolic disease. Lack or inadequate antidiabetic therapy combined with poor diet and other factors leads to hyperglycemia in which blood glucose levels can reach 10-12 mM. T2DM and accompanying hyperglycemia cause a variety of complications reducing quality of life, such as diabetic retinopathy, polyneuropathy, or diabetic foot disease. The major cellular component of the immune response are neutrophils which are essential part of innate immunity having broad range of protective and signaling functions. Neutrophils migrate to sites of inflammation, where they undergo activation resulting in degranulation or NETosis, both leading to exocytosis of the contents of cytoplasmic granules. As a result, various biologically active molecules, in particular myeloperoxidase (MPO), appear in the extracellular milieu. MPO catalyzes the formation of reactive halogen species (RHS) which exert antimicrobial actions, but at the same time their excessive production leads to halogenative stress, an imbalance between RHS and the body’s ability to neutralize their excess which causes damage to molecules, cells and tissues of the body [1]. Halogenative stress contributes to the development of cardiovascular, metabolic, neurodegenerative and other diseases. Thus, searching for means and approaches to regulate MPO blood level and to prevent halogenative stress is of great importance. Lactoferrin (LF) and vitamin D3 could be one of such therapeutics. LF is abundant in all secretory fluids, and it is also present in neutrophil specific granules. LF displays immunomodulatory, antimicrobial, antioxidant, and other biologically important functions [2]. Vitamin D3 and its metabolites have anti-inflammatory and antioxidant properties as well as prevent NETosis [3].

The aim of the work was to study the effects of LF and vitamin D3 on the content of MPO and the markers of halogenative stress and NETosis in blood of healthy individuals and T2DM patients during induced activation of neutrophils in ex vivo experiments.

Materials and Methods. The study involved 15 people of different sex, aged 45 to 86 years, among whom there were 8 healthy volunteers and 7 T2DM patients with persistent hyperglycemia (blood glucose level of > 7 mM, glycated hemoglobin level of 7-9%). Venous blood was collected in EDTA-containing vacuum tubes. LF and vitamin D3 were added to the blood to a concentration of 1 mg/ml and 5 ng/ml, respectively. Following incubation for 2 h at 37°C, neutrophils were activated by adding phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA, 0.16 μM) and incubated for another 0.5 h. After incubation, MPO, halogenative stress markers (chlorinated albumin (HSA-Cl), ceruloplasmin (CP-Cl), and low-density lipoproteins (LDL-Cl)) as well as DNA-MPO complex, a marker of NETosis, were determined in plasma by ELISA method [4].

Results. The ELISA study showed that addition of the neutrophil activator PMA to the blood of both healthy subjects and T2DM patients resulted in a significant increase in MPO, the markers of halogenative stress (HSA-Cl, CP-Cl and LDL-C) and the NETosis marker DNA-MPO. Preincubation of blood with LF significantly reduced all parameters under study by 40-90% compared to control. Incubation of blood with vitamin D3 significantly decreased DNA-MPO. A tendency to decrease MPO was also observed. The results indicate that LF and vitamin D3 can reduce neutrophil secretion of MPO and prevent NETosis. In addition, due to its effect on activated neutrophils, LF impedes halogenative stress.

Our results suggest that LF is able to translocate into the plasma membrane, making it difficult for neutrophil extracellular traps, which include MPO, to be released from the cell. This should decrease MPO concentration in plasma and, thereby, lead to a decrease in the markers of halogenative stress. The observed decrease in LDL-Cl levels can be explained by the ability of LF to compete with MPO for binding to the LDL surface. Due to displacing the functioning MPO from LDL-MPO complex, LF prevents LDL modification caused by MPO-produced RHS [5]. Vitamin D3 was able to reduce NETosis markers, which is in agreement with our previous data [3].

The results obtained extend the possibility of using LF and vitamin D3 as a basis for creating new tools and approaches aimed at the regulation and correction of neutrophil and MPO functions to prevent halogenative stress, which should have a positive effect on wound healing and the course of chronic inflammatory diseases.

The work was supported by grant from the Russian Science Foundation (20-15-00390).



References

1. Panasenko O.M., Torkhovskaya T.I., Gorudko I.V., Sokolov A.V. The role of halogenative stress in atherogenic modification of low-density lipoproteins. Biochemistry (Moscow). 2020. V. 85. Suppl. 1. P. S34-S55.

2. Terekhova M.S., Gorudko I.V., Grigorieva D.V., Semak I.V., Sokolov A.V., Panasenko O.M., Cherenkevich S.N. Iron-binding property of lactoferrin in the case of inflammation. Doklady BGUIR. 2018. V. 117(7). P. 80-84.

3. Basyreva L.Yu., Vakhrusheva T.V., Letkeman Z.V., Maximov D.I., Fedorova E.A., Panasenko O.M., Ostrovsky E.M., Gusev S.A. Effect of vitamin D3 in combination with omega-3 polyunsaturated fatty acids on NETosis in type 2 diabetes mellitus patients. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021. Article ID 8089696.

4. Sokolov A.V., Kostevich V.A., Gorbunov N.V., Grigorieva D.V., Gorudko I.V., Vasilyev V.B., Panasenko O.M. A link between active myeloperoxidase and chlorinated ceruloplasmin in blood plasma of patients with cardiovascular diseases. Medical Immunology (Russia). 2018. V. 20(5). P. 699-710.

5. Vasilyev V.B., Sokolov A.V., Kostevich V.A., Elizarova A.Y., Gorbunov N.P., Panasenko O.M. Binding of lactoferrin to the surface of low-density lipoproteins modified by myeloperoxidase prevents intracellular cholesterol accumulation by human blood monocytes. Biochem. Cell. Biol. 2021. V. 99. P. 109-116.