Ген white является первым геном, обнаруженным у дрозофилы, однако несмотря на более чем 100 летнюю историю его изучения, его физиологическое значение по-прежнему остается не до конца понятным. white кодирует полуканал, относящийся к подсемейству ABCG суперсемейства ABC-транспортеров, осуществляющих АТФ-зависимый активный транспорт (экспорт/импорт) веществ через мембрану клетки против градиента их концентрации. Сверхэкспрессия ABCG белков является причиной множественной лекарственной устойчивости, а их мутации приводят к возникновению наследственных синдромов и широкого спектра заболеваний пролиферативного и непролиферативного характера у человека. Это определяет важность изучения функциональных свойств генов и белков ABCG.

Наиболее близкими гомологами White дрозофилы являются ‒ ABCG4/White2 (81% сходства аминокислотной последовательности c White) и ABCG1/ABC8/White (51% сходства). Как и ABCG4 человека white экспрессируется преимущественно в мозге и в глазах. В последние годы открылась важная роль этого гена для целого ряда процессов в организме дрозофилы, таких как поддержание стволовых клеток, глюкозотолерантность, обучение и т.д. Более того, имеются некоторые данные относительно возможного участия white и похожих генов в контроле продолжительности жизни (ПЖ). Исходя из этого, представляет большой интерес на модели дрозофилы прояснить роль гена white в контроле ПЖ, а также изучить механизм влияния мутации white на ПЖ.

Недостатком работ, в которых ранее изучалось влияние white на ПЖ дрозофилы, является отсутствие выравнивания генетического фона между опытной (w1118, протяженная делеция локуса white с некартированными границами) и контрольной линиями. При изучении таких количественных признаков, как ПЖ, плодовитость и т.д. исследования следует выполнять с использованием максимально близкого генетического фона. В данной работе при помощи рекомбинации X-хромосомы y1w67c23 с X-хромосомами дикого типа линий Oregon RC и Canton S мы отделили мутацию w67c23 (короткая делеция промотора и первого экзона) от мутации y1. Далее с линией w67c23 были проведены 10 возвратных скрещиваний на исходные линии. Таким образом, были получены изогенные контрольные линии, несущие мутацией w67c23 на генетическом фоне Canton S и Oregon RC.

В серии тестов мы проанализировали влияние мутации white на ПЖ, состояние центральной нервной системы (ЦНС) и общебиологические функции организма дрозофил. В тестах на ЦНС и общебиологические функции различия между группами выявляли при помощи дисперсионного анализа (ANOVA). Для изучения влияния на ПЖ строили кривые выживаемости Каплана-Мейера и кривые смертности для самцов (М) и самок (F). Анализ кривых выживания проводили с использованием двухвыборочного теста Колмогорова-Смирнова. Скорость старения оценивали по кривым смертности используя критерия MRDT (удвоение скорости смертности с возрастом).

Обнаружили, что контрольные линии отличались по максимальной ПЖ (макс.ПЖ) (возраст 90% смертности Canton S: M=65 дней, F=73 дня; Oregon RC: M=61, F=60), а также демонстрировали достоверные различия по средней и медианной ПЖ (МПЖ) между М и F (Canton S МПЖ: M=51, F=59,5, p=<0,0001; Oregon RC МПЖ: M=48, F=36,5, p<0,0001), что хорошо соотносится с различиями в кривых смертности и скорости старения у М и F. Таким образом, в изогенных лабораторных линиях ПЖ между M и F отличается. Можно предполагать, что набор аллелей генов, контролирующих ПЖ, в этих линиях различен.

Введение в генотипы Canton S и Oregon RC мутации white практически не изменяло макс.ПЖ мух (возраст 90% смертности Canton S: M=65, F=73; wCanton S M=66, F=70; Oregon RC: M=61, F=60; wOregon RC: M=61, F=60). Однако, совершенно неожиданно оказалось, что половой диморфизм по МПЖ на фоне мутации white совершенно исчезает; ПЖ у M и F оказалась сопоставима и достоверно не различалась (wCanton S: M=54,5, F=55,5, p=0,558; wOregon RC: M=42, F=41, p=0,275). Итоговый эффект мутации white был характерен для обоих генетических фонов, но его направленность зависела от генотипа линии: на генетическом фоне Canton S мутация достоверно увеличивала МПЖ у М (Canton S: M=51, wCanton S M=54,5, p=0,001), но достоверно снижала МПЖ у F (Canton S F=59,5, wCanton S F=55,5, p=0,01), а на фоне Oregon RC – наоборот – достоверно снижала МПЖ у М (Oregon RС M=48, wOregon RС M=41, p=0,001), но достоверно увеличивала МПЖ у F (Oregon RC F=36,5, wOregon RC F=41, p=0,05). Таким образом, i) введение в генотип мутации гена, сцепленного с полом, уравнивает ПЖ у M и F, ii) направленность эффекта мутации white зависит от генов-модификаторов, влияющих на признак ПЖ, между которыми, очевидно, наблюдаются эпистатические взаимодействия.

Для оценки влияния мутации white на ЦНС изучали локомоторную активность (регистрировали движение мух) и половое поведение (оценивали успешность наступления копуляции). Различия были выявлены на обоих генетических фонах. При мутации происходило сглаживание двугорбого циркадного ритма активности мух и достоверное снижение общей двигательной активности (P<0,05). Копуляция у таких мух происходила отсрочено, причем не только у самцов, но и у самок (нарушен механизм восприятия ухаживания) (P<0,05). Таким образом, изменения в функционирования ЦНС на фоне мутации white, по-видимому, могут являться причиной пониженной активности мух.

Для оценки общебиологических эффектов мутации white изучали скорость развития, плодовитость и выживаемость зигот. Эти показатели были достоверно понижены на фоне мутации для обоих генетических фонов, по сравнению с контролем (P<0,05). Индекс конкуренции, являющийся характеристикой общей приспособленности линии (оценивается как число потомков в опытной линии, по отношению к тестерной и контрольной линиям), показал, что мутанты white демонстрируют очень низкую приспособленность ‒ ниже, чем у контрольной и тестерной линий (использовали линию со сцепленными вторыми хромосомами) (P<0,05).

Полученные данные демонстрируют роль ЦНС и группы генов ABCG в контроле ПЖ. Работа выполнена при поддержке РНФ 18-74-10051.

The white gene is the first gene discovered in Drosophila, but despite its more than 100-year history, the physiological significance of this gene is still not fully understood. white encodes a subfamily ABCG subunit of the ABC transporter superfamily that carries out ATP-dependent active transport (Influx/Efflux) of substances across the membrane against their concentration gradient. Overexpression of ABCG proteins causes multidrug resistance, and their mutations lead to hereditary syndromes and a wide range of proliferative and nonproliferative diseases in humans. All this determines the importance of studying the functional properties of ABCG genes and proteins.

The closest homologues of Drosophila White are ABCG4/White2 (81% similarity of the amino acid sequence with White) and ABCG1/ABC8/White (51% similarity). Like human ABCG4, white is expressed predominantly in the brain and eyes. In recent years, the role of the white gene for a number of important processes in Drosophila, such as stem cell maintenance, glucose tolerance, learning processes, etc., has been discovered. Moreover, there is some evidence regarding the possible involvement of this and similar genes in the control of lifespan and healthspan (HS). Based on the above, it is of great interest to elucidate the role of the white gene in controlling HS on the Drosophila model, as well as to study the mechanism of the effect of the white mutation on HS.

A shortcoming of the works that previously studied the effect of white on HS in Drosophila is the lack of genetic background alignment between the experimental (w1118, extended deletion of the white locus with unmapped boundaries) and control lines. When studying quantitative traits such as HS, fecundity, etc., studies should be performed using as close a genetic background as possible. In this work, using recombination of chromosome y1w67c23 with wild-type Oregon RC and Canton S, we separated mutation w67c23 (short deletion of the promoter and first exon) from mutation y1. Next, 10 backcrosses were made with the w67c23 line to the parental lines. Thus, isogenic control lines carrying the w67c23 mutation on the Canton S and Oregon RC genetic background were obtained.

In a series of tests, we analyzed the effect of the white mutation on HS, central nervous system (CNS) function, and general biological functions of Drosophila. In the tests for CNS and general biological functions, differences between the groups were detected by analysis of variance (ANOVA). Kaplan-Meier survival curves and mortality curves for male (M) and female (F) mutant and control lines were constructed to study the effect on HS. Survival curves were analyzed using the Kolmogorov-Smirnov two-sample test. The rate of aging was estimated from the mortality curves using the MRDT criterion.

We found that the control lines differed in maximal HS (maxHS) (age of 90% mortality Canton S: M=65 days, F=73 days; Oregon RC: M=61, F=60), and also showed significant differences in mean and median HS (MHS) between M and F (Canton S: M=51, F=59.5, p=<0.0001; Oregon RC: M=48, F=36.5, p<0.0001), which correlated well with differences in mortality and aging rate curves in M and F. Thus, in isogenic laboratory lines, the MHS between M and F is different. It can be assumed that the set of alleles of the genes controlling MHS are different in these lines.

The introduction of the white mutation into the Canton S and Oregon RC genotypes did not practically change the maxHS of the flies (age of 90% mortality Canton S: M=65, F=73; wCanton S M=66, F=70; Oregon RC: M=61, F=60; wOregon RC: M=61, F=60). However, quite unexpectedly, it turned out that sexual dimorphism by MHS in the white mutants completely disappeared; MHS in M and F was comparable and did not differ significantly (wCanton S: M=54.5, F=55.5, p=0.558; wOregon RC: M=42, F=41, p=0.275). The effect of the white mutation was characteristic of both genetic backgrounds, but its direction depended on the line genotype: in the Canton S genetic background, the mutation significantly increased MHS in M (Canton S: M=51, wCanton S M=54.5, p=0.001), but significantly decreased MHS in F (Canton S F=59.5, wCanton S F=55.5, p=0.01), while in the Oregon RC background, conversely, significantly decreased MHS in M (Oregon RC M=48, wOregon RC M=41, p=0.001), but significantly increased MHS in F (Oregon RC F=36.5, wOregon RC F=41, p=0.05). Thus, (i) introducing a sex-linked gene mutation into the genotype equalizes MHS in M and F, (ii) the effect of the white mutation depends on modifier genes affecting the MHS trait, between which there are obviously epistatic interactions.

To assess the effect of the white mutation on the CNS, locomotion and sexual behavior (the success of copulation was evaluated) were studied. Differences were detected in both genetic backgrounds. With the mutation, there was a flattening of the two-humped circadian rhythm of fly activity and a significant decrease in total locomotion (P<0.05). Copulation in such flies was delayed, not only in males, but also in females (the mechanism of courtship perception was impaired) (P<0.05). Thus, changes in the functioning of the CNS in white mutants, apparently, can be the reason for the decrease in the activity of flies.

To assess the general biological effects of the white mutation, the rate of development, fecundity, and survival of the zygotes were studied. These parameters were significantly reduced in white mutants in both genetic backgrounds (P<0.05). The competition index, which characterizes the overall fitness of the line (estimated as the number of offspring in relation to the tester and control lines), showed that white mutants showed very low fitness, which was lower than in the control and tester lines (the line with linked second chromosomes) (P <0.05).

The findings demonstrate the role of the CNS and ABCG genes in the control of MHS. The work was supported by the Russian Science Foundation 18-74-10051.