Болезнь Паркинсона (БП) представляет собой прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, при котором происходит гибель дофаминергических нейронов в черной субстанции. В литературе описаны наследственные формы БП, для которых характерны мутации в ряде генов, кодирующих белок альфа-синуклеин (мутации A30P, E46K, A53T и мультипликации генного локуса SNCA) и белки, связанные с митохондриальными функциями (мутации в генах PINK1, LRRK2, двойная мутация PINK1/Parkin). Много исследований посвящено выяснению молекулярных механизмов развития БП, среди которых выявлены накопление агрегатов альфа-синуклеина, митохондриальные нарушения, апоптотическая и неапоптотическая программируемая гибель клеток, нарушения аутофагии, стресс эндоплазматического ретикулума и нарушения кальциевого гомеостаза.

Считается, что ключевую роль в патогенезе БП играет дисфункция митохондрий. При этом нарушается работа комплекса I электрон-транспортной сети, усиливается продукция активных форм кислорода (АФК), накапливаются нарушения митохондриальных ДНК и изменяется активность митохондриальной сети. В настоящее время предполагается, что умеренная активация процессов, связанных с ремоделированием митохондриальной сети, таких как слияние и деление митохондрий и митофагия, может помочь нейронам избежать гибели во время болезни Паркинсона и вернуться к нормальной жизнедеятельности.

В работе были исследованы особенности наследственных клеточных моделей БП – культур фибробластов человека с мутациями в генах PINK1 и LRRK2, приводящих к развитию данной патологии, а также выявлены отличия исследуемых культур клеток от контрольных.

Методами флуоресцентной и конфокальной микроскопии было показано, что в клетках с мутацией PINK уровень внутриклеточного pH ниже, чем в контрольной культуре фибробластов, что может быть связано с измененным уровнем митофагии/аутофагии.

Нами был исследован уровень мито/аутофагии. Показано, что степень колокализации митохондрий и лизосом в фибробластах с мутациями значимо не отличалась от контрольных клеток. При анализе изменения уровня экспрессии мРНК генов-маркеров ауто/митофагии в модельных клетках выявлено увеличение экспрессии в генах, кодирующих белки Nix и Fundc1, участвующих в альтернативном (неканоническом) пути митофагии, опосредованном рецепторами, что указывает на компенсацию функций, затронутых мутациями.

Были оценены морфология и динамика митохондриального ретикулума (сети) в клеточных моделях БП и выявлено уменьшение средней длины митохондрий как в составе митохондриальных сетей, так и для индивидуальных митохондрий в клетках с мутацией PINK по сравнению с контролем. Данные подтверждены анализом экспрессии связанных с митохондриальной динамикой генов, в результате которого увеличивается уровень мРНК Fis1, отвечающего за митохондриальное деление.

Были выявлены различия биоэнергетического состояния клеток, а именно в уровнях митохондриального потенциала, NADH и восстановленного глутатиона, между контролем и клеточными моделями БП. В клетках с мутациями наблюдалось снижение митохондриального потенциала и уровня восстановленного глутатиона по сравнению с контрольными фибробластами.

Было определено, что скорость продукции АФК в митохондриях повышена в клетках с мутацией PINK1 относительно контрольных клеток. При этом мутантные клетки отличались сниженной кальциевой буферной емкостью митохондрий.

Была оценена жизнеспособность клеток в культурах фибробластов: количество мертвых клеток значимо не отличалось в контрольной культуре и в мутантных клетках Исследование генов-маркеров апоптоза выявило увеличение экспрессии лишь нескольких генов. Однако мутантные клетки оказались более чувствительны к стрессу, индуцированному добавлением экзогенной перекиси водорода.

Таким образом, в работе было показано, что в клетках с мутацией PINK1 уровень pH ниже, чем в контрольной культуре фибробластов. Несмотря на то, что базальная митофагия не увеличена в мутантных клетках, оценка морфологии митохондриальной сети в клетках PINK1 показала, что нарушена длина митохондрий в митохондриальных сетях и индивидуальных митохондриях. Также в этих клетках была повышена скорость продукции митохондриальных АФК, выявлены нарушения биоэнергетики и понижена кальциевая буферная емкость митохондрий. При этом жизнеспособность клеток в мутантных культурах в покое не отличается от таковой контрольных фибробластов.

Работа выполнена в рамках проекта РНФ № 22-24-01043.

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disease in which the death of dopaminergic neurons in the substantia nigra occurs. The literature describes hereditary forms of PD, which are characterized by mutations in a number of genes encoding the alpha-synuclein protein (mutations A30P, E46K, A53T and multiplications of the SNCA gene locus) and proteins associated with mitochondrial functions (mutations in PINK1, LRRK2, double mutation PINK1/Parkin). Many studies have been aimed at elucidating the molecular mechanisms of PD, among which the accumulation of alpha-synuclein aggregates, mitochondrial disorders, apoptotic and non-apoptotic programmed cell death, autophagy disorders, endoplasmic reticulum stress, and calcium homeostasis disorders have been identified.

It is believed that mitochondrial dysfunction plays a key role in the pathogenesis of PD. In this case, the operation of complex I of the electron transport chain is disrupted, reactive oxygen species (ROS) production is enhanced, mitochondrial DNA disorders are accumulated, and the activity of the mitochondrial network is changed. The current hypothesis is that moderate activation of processes associated with mitochondrial network remodeling (fusion, fission and mitophagy) may help prevent neurons' death during Parkinson's disease and return to normal activity of cell.

In this work, the features of hereditary cellular models of PD were studied - cultures of human fibroblasts with mutations in PINK1 and LRRK2, leading to the development of this pathology, and differences between the studied cell cultures and control ones were revealed.

Using fluorescence and confocal microscopy, it was shown that, the intracellular pH level is lower in cells with the PINK mutation than in the control fibroblast culture, that may be associated with an altered level of mitophagy/autophagy.

We have studied the level of mito/autophagy. It was shown that the degree of colocalization of mitochondria and lysosomes in fibroblasts with mutations did not differ significantly from control cells. Analysis of changes in the mRNA expression level of auto/mitophagy genes in model cells revealed an increase in the expression of genes encoding Nix and Fundc1 proteins involved in the alternative (non-canonical) receptor-mediated mitophagy pathway, which indicates compensation for functions affected by mutations.

The morphology and dynamics of the mitochondrial reticulum (network) in cell models of PD were evaluated and a decrease in the average length of mitochondria was found both in the mitochondrial networks and in individual mitochondria in cells with the PINK mutation compared with the control. The data were confirmed by analysis of the expression of genes associated with mitochondrial dynamics, which resulted in an increase in the mRNA level of Fis1 responsible for mitochondrial division.

The differences in the bioenergetic state of cells, namely in the levels of mitochondrial potential, NADH and reduced glutathione, between the control and cellular models of PD were revealed. In cells with mutations, a decrease in mitochondrial potential and the level of reduced glutathione were observed compared to control fibroblasts.

It was determined that the rate of ROS production in mitochondria is increased in cells with the PINK1 mutation relative to control cells. At the same time, the mutant cells were characterized by a reduced calcium buffer capacity of mitochondria.

The viability of cells in fibroblast cultures was assessed: the number of dead cells did not differ significantly in the control culture and in mutant cells. The study of apoptosis genes revealed an increase in the expression of few genes. However, mutant cells were more sensitive to stress induced by the addition of exogenous hydrogen peroxide.

Thus, it was shown in the work that in cells with the PINK1 mutation, the pH level is lower than in the control fibroblast culture. Despite the fact that basal mitophagy is not increased in mutant cells, evaluation of the morphology of the mitochondrial network in PINK1 cells showed that the length of mitochondria in mitochondrial networks and individual mitochondria is impaired. Also, in these cells, the rate of mitochondrial ROS production was increased, bioenergetics disorders were revealed, and the calcium buffer capacity of mitochondria was reduced. At the same time, the viability of cells in mutant cultures does not differ from that of control fibroblasts.

The work was supported by the Russian Science Foundation, project no. 22-24-01043.