Использование изменения окраски индикатора для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) было предложено достаточно давно как дешевая альтернатива радиометрическим и флюорометрическим методам [1]. Ключевым индикатором для этого анализа является резазурин (также известный как аламаровый синий), который имеет синий цвет, изменяющийся на розовый, когда резазурин восстанавливается до резоруфина из-за митохондриальной дыхательной активности жизнеcпособных микроорганизмов. Однако, будучи применяемым таким образом, он оставался качественным методом. Напротив, в нашей работе мы обращаемся к этому подходу количественно, раскрывая возможность определения параметров как кривой роста микобактерий, так и функционального отклика M. tuberculosis (MbT) на концентрацию препарата.

Работа выполнена на новом разработанном портативном микробиологическом анализаторе [2] (патент RU2779840C1, дата приоритета 2021-04-26) с использованием стандартного микобатериального штамма H37Rv в условиях роста в отсутствие лекарственного воздействия и под действием важного противотуберкулезного препарата первого ряда – изониазида. Установка позволяет автоматически регистрировать светопропускание ячеек микробиологического планшета в настроенном спектральном диапазоне с временным шагом 15 мин. Такая дискретизация дает возможность высокоточной регрессии данных сигмоидальными кривыми, описывающими двумерные карты динамики роста.

Отдельное обсуждение будет посвящено биохимическим и биофизическим механизмам, лежащим в основе количественной оценки процесса. Оно включает: (1) установление соответствия между концентрациями сосуществующих химических веществ, определяемыми спектральными методами, и компонентами фотометрического цветового пространства; (2) эффекты синхронизации роста и деления клеток в колониях микобактерий, что отражается в ступенчатости фотометрических кривых, обсуждаемых в сравнении со спектрофлуориметрическими [3].

[1] Yajko, D.M.; Madej, J.J.; Lancaster, M.V. et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol., 1995, 33, 2324-2327.

[2] Sychev, A.V.; Belenkov, R.N.; Ukolov, D.N.; Budaev, A.V.; Lavrova, A.I.; Postnikov, E.B. Revealing kinetics of chemical transitions in colorimetric indicators of microorganisms growth based on photometric data from a portable microbiological analyser. Proc. SPIE. 2022, 12194, 121940Z.

[3] Lavrova, A.I.; Dogonadze, M.Z.; Sychev, A.V.; Manicheva, O.A., Postnikov, E.B. Ensemble density-dependent synchronization of mycobacterial growth: BACTEC MGIT 960 fluorescence-based analysis and mathematical modelling of coupled biophysical and chemical processes. AIMS Microbiol., 2022, 8208

The usage of an indicator’s colour change for the minimum inhibitory concentration (MIC) determining was proposed a sufficiently long time ago as a cheap alternative to radiometric and fluorometric instrumentation methods [1]. The key indicator substance for this application is resazurin (also known as Alamаr Blue), which has blue colour changing to pink when resazurin reduces to resorufin due to the mitochondrial respiratory activity of viable microorganisms. However, in such a way it remained a qualitative method. On the contrary, in our work we address this approach quantitatively, revealing the possibility to determine parameters for both the mycobacterial growth curve and the functional response of M. tuberculosis (MbT) on a drug’s concentration.

The work was carried out with a newly developed portable microbiological analyser [2] (patent RU2779840C1, priority date 2021-04-26) using the standard MbT strain H37Rv under the condition of the treatment-free growth and the action of the essential first-line antituberculosis drug isoniazid. The setup allows automated recording of light transmittance of the microbiological plate’s cells in an adjusted spectral window with 15 min time steps. Such a discretization provides an opportunity for highly accurate data fitting to sigmoidal curves describing two-dimensional maps of the growth dynamics.

A special discussion will be devoted to the biochemical and biophysical mechanisms underlying the process quantification. It includes: (i) establishing a correspondence between concentrations of coexisting chemicals determined by spectral methods and components of photometric colour space; (ii) effects of the cell growth and division synchronization in mycobacterial colonies as reflected in a staged character of photometric curves discussed in the comparison to spectrofluorimetric ones [3].

[1] Yajko, D.M.; Madej, J.J.; Lancaster, M.V. et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol., 1995, 33, 2324-2327.

[2] Sychev, A.V.; Belenkov, R.N.; Ukolov, D.N.; Budaev, A.V.; Lavrova, A.I.; Postnikov, E.B. Revealing kinetics of chemical transitions in colorimetric indicators of microorganisms growth based on photometric data from a portable microbiological analyser. Proc. SPIE. 2022, 12194, 121940Z.

[3] Lavrova, A.I.; Dogonadze, M.Z.; Sychev, A.V.; Manicheva, O.A., Postnikov, E.B. Ensemble density-dependent synchronization of mycobacterial growth: BACTEC MGIT 960 fluorescence-based analysis and mathematical modelling of coupled biophysical and chemical processes. AIMS Microbiol., 2022, 8208