Различные патологические состояния, такие как нейродегенерация, сердечно-сосудистые заболевания, рак и старение связаны с нарушением функций митохондрий и, в частности, митохондриальной мегапоры (mPTP). Открытие mPTP приводит к резкому увеличению проницаемости митохондриальной мембраны, потере митохондриального потенциала и запуску запрограммированной клеточной гибели – апоптоза, либо некроза. В свою очередь открытие mPTP может быть вызвано чрезмерной продукцией АФК, перегрузкой кальцием, низкой доступностью субстрата, ингибированием дыхательных комплексов митохондрий и т.д. Предполагают, что в опухолевых клетках нарушен механизм запуска апоптоза, опосредуемый mPTP, в то время как при нейродегенерации токсичность белковых агрегатов, таких как а-синуклеина, опосредована открытием mPTP.

Известно, что открытие mPTP – это универсальный механизм индукции апоптоза для различных типов клеток млекопитающих, однако, до сих пор не было установлено количественное соотношение митохондрий с открытыми mPTP к общему пулу митохондрий клетки, необходимое для запуска клеточной гибели.

Чтобы проверить это соотношение мы выбрали четыре типа клеток млекопитающих: нейроны, астроциты, клетки рака молочной железы и фибробласты. Клетки загружали потенциал-чувствительным красителем TMRM (25нМ) и флуоресцентным субстратом каспазы3 NucView (2мкМ). Далее проводили поэтапное введение ферутинина – электрогенного ионофорного индуктора открытия mPTP, опосредующего увеличение проницаемости митохондриальной мембраны и кальциевую перегрузку митохондрий. Открытие mPTP происходит, если добавка ферутинина сопровождается быстрой потерей митохондриального потенциала и угасанием флуоресценции TMRM. Далее вычисляли процент митохондрий с открытыми mPTP во время индукции апоптоза (о котором свидетельствовало резкое увеличение флуоресценции NucView) к общему пулу митохондрий в начальный момент съёмки (начальная митохондриальная площадь, 100%).

Было обнаружено, что для индукции апоптоза в фибробластах необходим наименьший процент митохондрий с открытыми mPTP (25±1,4%). В нейронах же для индукции апоптоза требовалось 64 ±4% митохондрий с открытыми mPTP, в то время как в астроцитах это значение составляло 77±5%. В опухолевых клетках, несмотря на большую гетерогенность данных, для индукции апоптоза была необходимо открытие mPTP в более чем 90±8% митохондрий.

Поскольку эволюционная роль нейронов и астроцитов прочно связана с кальциевой сигнализацией, вероятно, такие различия в этом показателе могут объясняться более низкой чувствительностью нейрональных и астроцитарных митохондрий к кальциевой перегрузке по сравнению с митохондриями фибробластов. Для опухолевых же клеток, характерна высокая скорость митофагии и аутофагии, которая, возможно, до определённого момента сдерживает индукцию апоптоза, несмотря на активацию mPTP в большинстве митохондрий клетки.

Таким образом, в настоящей работе получены данные, описывающие порог чувствительности к индукции апоптоза через открытие mPTP и кальциевую перегрузку в разных типах клеток. Поскольку вещества, модулирующие работу mPTP рассматриваются в качестве потенциальной мишени для терапии различных заболеваний, необходимо детальное изучение чувствительности митохондрий различных типов клеток к их действию.

Работа выполнена в рамках государственного задания ИБК РАН № 075-01512-22-03 по теме: "Нейропротекторные препараты нового поколения" № 1022080100047-5-1.6.4

Various pathological conditions such as neurodegeneration, cardiovascular diseases, cancer and aging are associated with impaired mitochondrial function and, in particular, mitochondrial pore (mPTP). The opening of mPTP leads to a acute increase in the permeability of the mitochondrial membrane, loss of mitochondrial potential and triggering programmed cell death – apoptosis or necrosis. In turn, the opening of mPTP may be caused by ROS overproduction, calcium overload, low substrate availability, inhibition of mitochondrial respiratory complexes, etc. It is assumed that the mechanism of triggering apoptosis mediated by mPTP is disrupted in tumor cells, while in neurodegeneration, the toxicity of protein aggregates, such as a-synuclein, is mediated by the opening of mPTP.

It is known that the opening of mPTP is a universal mechanism of induction of apoptosis for various types of mammalian cells, however, the quantitative analisis of mitochondria with opened mPTP vs. total pool of mitochondria of the cell necessary to trigger cell death has not yet been established.

To study this parameter, we selected 4 mammalian cell types: neurons, astrocytes, breast cancer cells, and fibroblasts. The cells were loaded with a potential-sensitive TMRM dye (25 nM) and a fluorescent substrate of caspase 3 NucView (2 uM). Next, a step–by-step application of ferutinin (an electrogenic ionophore inducer of mPTP opening), mediating an increase in the permeability of the mitochondrial membrane and calcium overload of mitochondria, was carried out. The opening of mPTP occurs if the addition of ferutinin is accompanied by a rapid loss of mitochondrial potential and the extinction of TMRM fluorescence. The percentage of mitochondria with opened mPTP during the induction of apoptosis (which was evidenced by a sharp increase in NucView fluorescence) to the total pool of mitochondria at the initial moment of recording (initial mitochondrial area, 100%) was calculated.

It was found that the lowest percentage of mitochondria with opened mPTP (25±1.4%) is required for the induction of apoptosis in fibroblasts. In neurons, 64 ±4% of mitochondria with opened mPTP were required to induce apoptosis, while in astrocytes this value was 77± 5%. In tumor cells, despite the large heterogeneity of the data, the induction of apoptosis required the opening of mPTP in more than 90 ± 8% of mitochondria.

Since the evolutionary role of neurons and astrocytes is strongly associated with calcium signaling, it is likely that such differences in this indicator can be explained by the lower sensitivity of neuronal and astrocytic mitochondria to calcium overload compared to fibroblast mitochondria. Tumor cells, on the other hand, are characterized by a high rate of mitophagy and autophagy, which may restrain the induction of apoptosis, despite the opened of mPTP in most mitochondria of the cell.

Thus, in this paper, the threshold of sensitivity to the induction of apoptosis through the opening of mPTP and calcium overload in different types of cells is described. Since substances that modulate the work of mPTP are considered as a potential target for the treatment of various diseases, it is necessary to study in detail the sensitivity of mitochondria in various cell types to their action.

This study was conducted in the framework of the State assignment of PSCBR RAS № 075-01512-22-03 «New generation neuroprotective drugs» № 1022080100047-5-1.6.4.