Метилглиоксаль (МГ) – это высокореакционный α-кетоальдегид, образующийся в организме человека как побочный продукт ряда метаболических путей, в частности, в результате неферментативного окисления глюкозы при гипергликемии и сахарном диабете [1]. Миелопероксидаза (MПO; EC 1.11.2.2), локализованная в азурофильных гранулах нейтрофилов, катализирует образование активных форм галогенов, что является ключевым фактором антибактериальной активности нейтрофилов [2]. Было показано, что воздействие конечных продуктов гликирования (КПГ) на нейтрофилы стимулирует экспрессию клетками MПO [3]. Обнаруженный ранее парадоксальный рост фагоцитарной способности и экспрессии MПO вместе с увеличением внутриклеточной персистенции бактерий в КПГ-стимулированных нейтрофилах заставил нас предположить, что КПГ могут ингибировать активность MПO и, следовательно, бактерицидную функцию нейтрофилов [4]. Нашей целью было выяснить, влияет ли модификация сывороточного альбумина человека (ЧСА) в условиях гипергликемии на ферментативную активность MПO, ее высвобождение из нейтрофилов путем дегрануляции и нетоза, генерацию нейтрофилами активных форм кислорода (АФК) и галогенов (АФГ), которые являются ключевыми факторами бактерицидной активности нейтрофилов. С этой целью ЧСА, основной белок плазмы крови человека, модифицировали с помощью МГ, моделируя вызванное гипергликемией повреждение белка. Было изучено влияние ЧСА, модифицированного МГ (ЧСА-МГ) на ферментативную активность MПO и функциональную активность нейтрофилов.

Методы исследования. Пероксидазную активность МПО регистрировали по окислению 2,2'-диазинобис(3-этилбензотриазолин-6-сульфоната) аммония, хлорирующую – по обесцвечиванию красителя целестинового синего В. Связывание МПО с ЧСА-МГ исследовали методом диск-электрофореза, а также на твердой фазе с использованием моноклональных антител против МПО. Продукцию нейтрофилами АФК и АФГ регистрировали методом хемилюминесценции в присутствии люцигенина и люминола, соответственно. Дегрануляцию нейтрофилов исследовали методом проточной цитофлуориметрии, регистрируя экспрессию на поверхности клеток маркеров азурофильных (CD63) и пероксидазо-негативных (специфических/желатиназных) гранул (CD11b) с использованием флуоресцентно меченых антител. Нетоз оценивали по образованию нейтрофильных внеклеточных ловушек в мазках крови, окрашенных по Романовскому.

Результаты. Показано, что ЧСА-МГ связывается с МПО, образуя прочный комплекс (Kd = 1,1 нМ), что подтверждает конкуренция ЧСА-МГ с моноклональными антителами против МПО. ЧСА-МГ ингибировал пероксидазную и хлорирующую активности МПО по неконкурентному механизму. Установлено, что ЧСА-МГ стимулировал дегрануляцию пероксидазо-негативных гранул, но не вызывал экзоцитоз содержимого азурофильных гранул, в том числе МПО. Кроме того, ЧСА-МГ увеличивал хемилюминесценцию нейтрофилов в присутствии люцигенина сам по себе, а также в ответ на добавление активатора форбол-12-миристат-13-ацетата, что свидетельствует о прайминге и активации НАДФН-опосредованной продукции нейтрофилами АФК. В то же время ЧСА-МГ не влиял на хемилюминесценцию нейтрофилов в присутствии люминола, то есть на продукцию АФГ, образующихся при участии МПО. ЧСА-МГ не вызывал нетоз и не влиял на нетоз, активированный форбол-12-миристат-13-ацетатом.

Выводы. Таким образом, ЧСА, модифицированный в условиях моделирования гипергликемии, стимулирует НАДФН-оксидазу нейтрофилов, но не активирует их функции, связанные с дегрануляцией азурофильных гранул и секрецией МПО, ингибируя при этом ее ферментативную активность. Это может лежать в основе снижения бактерицидной активности МПО и нейтрофилов в целом, ослабления врожденного иммунитета, трудностей при заживлении ран и повышенной чувствительности к инфекции при гипергликемии.

Работа поддержана Российским научным фондом (20-15-00390).



Литература

1. John W.G., Lamb E.J. The Maillard or browning reaction in diabetes. Eye. 1993, 7, 230-237.

2. Klebanoff S.J. Myeloperoxidase: friend and foe. J. Leukoc. Biol. 2005, 77, 598-625.

3. Lu H., Xu S., Liang X., Dai Y., Huang Z., Ren Y., Lin J., Liu X. Advanced glycated end products alter neutrophil effect on regulation of CD4+ T cell differentiation through induction of myeloperoxidase and neutrophil elastase activities. Inflammation. 2019, 42, 559-571.

4. Collison K.S., Parhar R.S., Saleh S.S., Meyer B.F., Kwaasi A.A., Hammami M.M., Schmidt A.M., Stern D.M., Al-Mohanna F.A. RAGE-mediated neutrophil dysfunction is evoked by advanced glycation end products (AGEs). J. Leukoc. Biol. 2002, 71, 433-444.

Methylglyoxal (MG) is a highly reactive α-ketoaldehyde generated in human body as a by-product of a number of metabolic pathways and due to non-enzymatic glucose oxidation in hyperglycemia and diabetes mellitus [1]. Myeloperoxidase (MPO; EC 1.11.2.2) stored in neutrophil azurophilic granules catalyzes generation of reactive halogen species which is a key factor of neutrophil antibacterial activity [2]. It has been shown that exposure of neutrophils to advanced glycation end products (AGEs) stimulates cellular expression of MPO [3]. The previously discovered paradoxical growth in phagocytic capacity and in MPO expression together with increase in intracellular bacterial persistence in AGEs-stimulated neutrophils made us hypothesize that AGEs could inhibit MPO enzymatic activity and hence, bactericidal function of neutrophils [4]. Our aim was to elucidate if modification of human serum albumin (HSA) under hyperglycemia-like conditions affects enzymatic activity of MPO, its release from neutrophils by degranulation and NETosis, generation of reactive oxygen (ROS) and halogen species (RHS) by neutrophils, which are key factors of neutrophil bactericidal activity.

Methods. Peroxidase activity of MPO was registered by oxidation of 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt, and its chlorinating activity – by decolorization of Celestine blue B dye. Binding of HSA-MG to MPO was studied by disk-electrophoresis and also by solid phase immunoassay using monoclonal antibodies to MPO. ROS and RHS generation were detected by lucigenin and luminol chemiluminescence (CL), respectively. Neutrophil degranulation was assessed by flow cytofluorometry using the fluorescent labeled antibodies to the marker proteins CD63 from azurophilic granule and CD11b from peroxidase-negative specific/gelatinase granules. NETosis was assayed by quantifying of NETs in blood smears colored by Romanovsky.

Results. It was shown that HSA-MG binds to MPO giving a stable complex (Kd = 1.1 nM) which is consistent with the data on competition of HSA-MG with monoclonal antibodies to MPO. HSA-MG non-competitively inhibited peroxidase and chlorinating activity of MPO. It also induced degranulation of peroxidase-negative granules with no impact on exocytosis of the content of azurophilic granules, including MPO. Moreover, HSA-MG enhanced lucigenin CL of neutrophils in itself or under their stimulation with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) suggesting effects on priming and activation of NADPH-oxidase mediated ROS production. At the same time, HSA-MG did not influence luminol CL of neutrophils which depends mainly on MPO-mediated RHS production. HSA-MG did not induce NETosis and did not affect NETosis stimulated with PMA.

Conclusions. Thus, HSA modified under hyperglycemia-like conditions, stimulated NADPH oxidase in neutrophils but did not activate their functions dependent on azurophil granule degranulation and MPO secretion, inhibiting its enzymatic activity. This phenomenon could underlie downregulation of bactericidal activity of MPO and neutrophil, and hence, of innate immunity, giving rise to wound healing impairment and susceptibility to infection in patients with hyperglycemia.

This work was supported by the Russian Science Foundation (20-15-00390).



References

1. John W.G., Lamb E.J. The Maillard or browning reaction in diabetes. Eye. 1993, 7, 230-237.

2. Klebanoff S.J. Myeloperoxidase: friend and foe. J. Leukoc. Biol. 2005, 77, 598-625.

3. Lu H., Xu S., Liang X., Dai Y., Huang Z., Ren Y., Lin J., Liu X. Advanced glycated end products alter neutrophil effect on regulation of CD4+ T cell differentiation through induction of myeloperoxidase and neutrophil elastase activities. Inflammation. 2019, 42, 559-571.

4. Collison K.S., Parhar R.S., Saleh S.S., Meyer B.F., Kwaasi A.A., Hammami M.M., Schmidt A.M., Stern D.M., Al-Mohanna F.A. RAGE-mediated neutrophil dysfunction is evoked by advanced glycation end products (AGEs). J. Leukoc. Biol. 2002, 71, 433-444.