Мускариновые холинорецепторы (мХР) — это подтип рецепторов, восприимчивых к мускарину и ацетилхолину. Выделяют пять подтипов мХР (М1-М5), которые являются надсемействами рецепторов, связанных с G-белком. Исследования, проведенные ранее показывают, что все известные на данные подтипы мХР играют существенную роль в регуляции функций сердечно-сосудистых, желудочно-кишечных, двигательных, а также вовлечены в процессы обучения, запоминания и формирования поведенческих реакций. Более подробное изучение функций мХР затруднено малым количеством специфичных к каждому типу фармакологических агентов, с помощью которых можно воздействовать на молекулярные механизмы, сопряженные с этими рецепторами.

Особый интерес вызывает М5 подтип мХР. Так, имеются данные, что дисфункция М5 подтипа сопряжена с шизофренией, болезнью Альцгеймера и особенностями течения наркомании и алкоголизма. Так же было показано наличие этого подтипа мХР на мышечных волокнах, но их роль в регуляции синаптических функций в нервно-мышечных синапсах ещё только предстоит изучить. Новые разработки фармакологических агентов привели к созданию соединения VU-0238429 - первого селективного положительного аллостерического модулятора (ПАМ) мХР М5 подтипа.

Известно, что холинорецепторы являются мишенью для свободных радикалов, в том числе - активных форм кислорода (АФК), которые образуются как при нормальном функционировании скелетной мышцы, так и при ряде патологических ситуаций (воспалительные процессы, длительное отсутствие мышечной активности, отравление тяжелыми металлами). В свою очередь, активация некоторых подтипов мХР также приводит к повышению продукции оксида азота и АФК.

Целью данного исследования было проанализировать эффекты положительной модуляции М5 мХР в норме и в условиях повышенной продукции АФК в синапсах скелетных мышц мыши.

Материалы и методы. Исследования проводились на изолированных нервно-мышечных препаратах диафрагмальной мышцы мыши линии BALB/c с помощью экстраклеточного отведения потенциалов концевой пластинки (ПКП). Регистрировали ПКП, вызванные стимуляцией двигательного нерва парными импульсами с периодом 14 мс и последующим периодом покоя длительностью 2 с и спонтанно возникающие «миниатюрные» ПКП (МПКП). Для перфузии препарата использовался физиологический раствор с близким к физиологическому (2 мМ) содержанием Са2+. Для положительной модуляции М5 мХР использовали соединение VU-0238429 в концентрации 1 мкМ. Для повышения уровня АФК нервно-мышечный препарат инкубировали 20 мин в растворе железа (Fe2O12 S3·xH2O, 0.1 мМ). Оценивали амплитудно-временные параметры ПКП и МПКП, а также квантовый состав ПКП (соотношением амплитуд вызванных и спонтанных сигналов) для первого и второго стимулов.

Результаты. Параметры спонтанно возникающих МПКП, а именно частота сигналов, их амплитуда, а также время роста и постоянная времени спада (на уровне 10-90% амплитуды) сигналов в присутствии прооксиданта - железа достоверно не изменялись. Квантовый состав ПКП на первый и второй стимулы и временные параметры сигналов также не изменялись после инкубации в растворе с прооксидантом - железом.

Установлено, что квантовый состав вызванных ПКП в присутствии ПАМ - соединения VU-0238429, увеличивался на 22%. Однако после инкубации препарата в растворе, содержащем железо, добавление соединения VU-0238429 уже не приводило к изменению квантового состава постсинаптических ответов ни на первый, ни на второй импульсы при парной стимуляции. Параметры МПКП после добавления ПАМ также не менялись.

Выводы. Эффекты положительной модуляции М5 холинорецепторов на параметры ПКП в синапсах мыши позволяют предположить, что эти рецепторы присутствуют на мембране двигательных нервных окончаний и участвуют в регуляции нейросекреции. Имитация условий оксидативного стресса для изолированного нервно-мышечного препарата, вызванная инкубацией скелетной мышцы в растворе с прооксидантом - железом, не оказывает влияние на амплитудно-временные параметры ПКП и МПКП, однако предотвращает эффекты модулятора М5 мХР на квантовый состав ПКП. Таким образом, М5 мХР могут быть мишенью для активных форм кислорода, что необходимо учитывать при разработке лекарственных препаратов на основе мускариновых агентов.

Muscarinic cholinergic receptors (mAChRs) are a subtype of receptors sensitive to muscarine and acetylcholine. There are five subtypes of mAChRs (M1-M5), which are superfamilies of G protein-coupled receptors. Previous studies show that all known mAChR subtypes play a significant role in the regulation of cardiovascular, gastrointestinal, motor functions, and are also involved in the processes of learning, memorization, and the formation of behavioral responses. A more detailed study of mAChRs functions is hampered by the small number of pharmacological agents specific to each type, which can be used to influence the molecular mechanisms associated with these receptors.

M5 subtype mAChRs are of particular interest. There is evidence that the dysfunction of the M5 subtype is associated with schizophrenia, Alzheimer's disease and the drug addiction and alcoholism. The presence of this mAChRs subtype on muscle fibers has also been shown, but their role in the regulation of synaptic functions at neuromuscular junction has yet to be studied. New developments in pharmacological agents have led to the creation of the compound VU-0238429, the first M5 selective positive allosteric modulator (PAM).

It is known that cholinergic receptors are the target for free radicals, including reactive oxygen species (ROS), which are formed both during the normal functioning of the skeletal muscle and in a number of pathological situations (inflammatory processes, prolonged lack of muscle activity, heavy metal poisoning). In turn, the activation of some mAChRs subtypes also leads to an increase in the production of nitric oxide and ROS.

The aim of this study was to analyze the effects of positive modulation of M5 mAChRs under normal conditions and under conditions of increased ROS production in mouse skeletal muscle synapses.

Materials and methods. The studies were carried out on isolated neuromuscular preparations of the BALB/c mouse diaphragm muscle using extracellular endplate potentials (EPPs) recording technique. EPPs induced by the motor nerve stimulation with paired pulses (14 ms period followed by a rest period of 2 s) and spontaneously occurring "miniature" EPPs (MEPPs) were recorded. The preparation was perfused with physiologically relevant, Ringer-Krebs saline. For positive modulation of M5 mAChRs, compound VU-0238429 was used at a concentration of 1 μM. To increase the level of ROS, the neuromuscular preparation was incubated for 20 min in an iron containing solution (Fe2O12 S3 xH2O, 0.1 mM). The amplitude and temporal parameters of EPPs and MEPPs, as well as the EPP quantum content (estimated by the ratio of the amplitudes of evoked and spontaneous signals) for the first and second stimuli were evaluated.

Results. The parameters of spontaneously occurring MEPPs, namely the frequency of signals, their amplitude, as well as the 10-90% rise time and 10-90% decay time in the presence of a prooxidant did not change significantly. The EPP quantum content for the first and second stimuli and the temporal parameters of the signals also did not change after incubation in a Fe2+ containing solution.

Previously, we found that the EPP quantum content in the presence of PAM (compound VU-0238429) increased by 22%. However, after incubation of the preparation in a prooxidant containing solution, the addition of VU-0238429 did not lead to a change in the quantum content of postsynaptic responses to either the first or second impulses during paired stimulation. The MEPP parameters also did not change after the addition of PAM.

Conclusions. The effects of positive modulation of M5 cholinergic receptors on EPP parameters in mouse synapses suggest that these receptors are present on the membrane of motor nerve endings and are involved in the regulation of neurosecretion. Simulation of oxidative stress conditions for an isolated neuromuscular preparation caused by incubation of a skeletal muscle in a solution with a prooxidant – Fe2+, does not affect the amplitude and temporal parameters of EPPs and MEPPs, but prevented the effects of the M5 mAChRs modulator on the quantal content of EPPs. Thus, M5 mAChRs can be a target for reactive oxygen species, which should be taken into account when developing drugs based on muscarinic agents.