Адгезивные свойства внеклеточных матриксов, преимущественно зависящие от химических и структурных особенностей их поверхности, играют важную роль в тканевой инженерии, а морфология и структура поверхности матриксов являются определяющей для роста и развития клеток. Разработка искусственных внеклеточных матриксов из биополимерных материалов с оптимальными характеристиками для процессов клеточной адгезии имеет большое значение для регенеративной медицины.

Первичные нейрональные культуры используются не только для фундаментальных исследований, но также для разработки методов лечения неврологических патологий и травм, а регенерация нервной ткани по-прежнему остается серьезной проблемой для медицины. Имплантация, адгезия и рост культуры нейронов требует подходящих матриксов. На сегодняшний день одним из наиболее перспективных для имплантатов синтетическим полимером является полилактид (ПЛА), обладающий хорошей биосовместимостью даже несмотря на гидрофобную природу соединения. В качестве искусственных матриксов могут применятся различные типы биополимерных материалов – пленки, губки и нетканые волокнистые материалы. Для оптимизации микроструктуры поверхности матриксов в целях улучшения гидрофильности поверхности и взаимодействия с клетками предлагается обработка образцов низкоэнергетичной плазмой в воздушной смеси.

В настоящей работе исследовалось влияние плазменной обработки полилактидных матриксов различных типов – пленок, губок и нетканых волокнистых материалов – на их морфологию, гидрофильность поверхности и адгезию культивированных на них нейрональных клеток новорожденных мышей. Образцы полимерных материалов обрабатывались плазмой (продолжительность обработки 30 и 60 минут) и сравнивались с контрольными (необработанными) образцами. Определение морфологических особенностей матриксов проводилось методами растровой электронной микроскопии (РЭМ). Полученные в ходе исследования РЭМ-изображения позволили увидеть эволюцию морфологии полимерных матриксов вследствие плазменной обработки (образование поверхностного рельефа), однако для численной оценки данных изменений потребовалось применить специальный метод трехмерной реконструкции поверхности по двум изображениям с РЭМ (стереопаре) на базе стереофотограмметрического подхода [1]. В результате были получены полноценные трехмерные модели поверхностей образцов, что позволило подсчитать ряд количественных характеристик, характеризующих изменение рельефа (шероховатости) и реальной площади поверхности при ее модификации плазмой, и сравнить их для модифицированных и контрольных образцов [2]. Для подтверждения результатов проводились также измерения удельной площади поверхности методом БЭТ (метод Брунауэра, Эммета и Теллера [3]). Кроме этого, методом РЭМ в условиях естественной среды исследована смачиваемость поверхности после модификации плазмой. Общая трехмерная морфология матриксов исследовалась методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии [4,5].

В работе представлены результаты исследования адгезии культуры клеток первичных нейронов мыши на различных матриксах из ПЛА, а именно, ориентированных и неориентированных нетканых и губчатых матриксах до и после обработки плазмой. С помощью флуоресцентной и растровой электронной микроскопии в режиме естественной среды была исследована адгезия клеток диссоциированной нейрональной культуры на изотропных и анизотропных нетканых и губчатых матриксах из ПЛА.

В результате выявлено, что обработка плазмой ведет к образованию рельефа на поверхностях всех рассматриваемых типов матриксов, заметно увеличивая шероховатость, причем параметрами модификации поверхности возможно управлять, изменяя время воздействия плазмы на образцы, а также улучшает их гидрофильность. Нейроны, полученные из головного мозга новорожденных мышей, демонстрировали улучшенную адгезию на матриксах всех типов после обработки плазмой, при этом наиболее выраженный эффект наблюдался на неориентированных матриксах. Таким образом, показано, что изменение морфологии поверхности и гидрофильности полимерных матриксов позволяет повысить клеточную адгезию культур нейронов.

Работа была проведена при финансовой поддержке РНФ (грант № 21-13-00321 “Деформационное поведение биоразлагаемых матриксов различного типа при механических нагрузках”).



1. Михуткин А.А. и др. Трехмерная реконструкция поверхности по изображениям, полученным в растровом электронном микроскопе // Кристаллография. 2014. Т. 59. С. 999.

2. Ястремский Е.В. и др. Модификация поверхности биомедицинских матриксов плазменной обработкой // Кристаллография. 2022. Т. 67. С. 451.

3. Брунауэр С. Адсорбция газов и паров. Издатинлит, Москва. 1948.

4. Mikhutkin A.A. et al. Towards Tissue Engineering: 3D Study of Polyamide-6 Scaffolds // BioNanoScience. 2018. Vol. 8. P. 511.

5. Tenchurin T.K. et al. The Performance of Nonwoven PLLA Scaffolds of Different Thickness for Stem Cells Seeding and Implantation // Polymers. 2022. Vol. 14. P. 4352.

Extracellular matrices adhesive properties mainly depend on chemical and structural features of their surface and play an important role in tissue engineering. The matrix surface morphology and structure are crucial for the cell adhesion and proliferation. Thus, development of artificial extracellular matrices from biopolymer materials with optimal characteristics for the cell adhesion processes is of great importance for regenerative medicine.

Primary neurons are used not only for the basic research, but also for the treatment of neurological pathologies and injuries, while nerve tissue regeneration remains a major challenge for medicine. Implantation, adhesion and growth of neurons requires appropriate matrices. Currently, one of the most promising synthetic polymers for implants is polylactide (PLA), which has good biocompatibility even despite the hydrophobic nature of the compound. Various types of biopolymer materials - films, sponges and nonwoven fibrous materials - can be used as artificial matrices. It was proposed the treatment of the samples with low-energy plasma in order to optimize the matrices surface microstructure and consequently to improve the surface hydrophilicity and interaction with cells.

In the present work we studied the effect of the plasma treatment of polylactide matrices of different types - films, sponges and nonwoven fibrous materials - on their morphology, surface hydrophilicity and adhesion of newborn mouse neuronal cells. Samples were subjected to air plasma treatment (treatment duration of 30 and 60 minutes) and were compared with control (raw) samples. The matrices morphological properties were determined by scanning electron microscopy (SEM). SEM images obtained during the study allowed us to see the evolution of polymer matrix morphology caused by plasma treatment (surface relief formation). For numerical evaluation of these changes three-dimensional surface reconstruction method using two SEM images (stereo pair) based on the stereophotogrammetric approach [1] was applied. The obtained three-dimensional models of the specimen surfaces allowed us to calculate a number of quantitative parameters characterizing the change in the relief (roughness), including the real surface area, during plasma modification, in comparison to the control specimens [2]. To confirm the results, the specific surface area was also measured by the BET method (Brunauer, Emmet and Teller method [3]). In addition, the surface wettability after plasma treatment was investigated by environmental SEM. The matrices general three-dimensional morphology was studied by confocal laser scanning microscopy [4,5].

We present the study of mouse primary neuronal cells adhesion on PLA matrices of various types, namely, oriented and non-oriented nonwoven fibrous and sponge matrices before and after plasma treatment. Fluorescence and environmental scanning electron microscopy were used to study the adhesion of dissociated neuronal cells on isotropic and anisotropic nonwoven fibrous and sponge PLA matrices.

As a result, it was found that plasma treatment leads to the formation of surfaces relief on all types of matrices, significantly increasing the roughness, as well as improving their hydrophilicity. The surface modification parameters can be controlled by changing the plasma exposure time. The neurons obtained from the brain of newborn mice showed improved adhesion on matrices of all types after plasma treatment, with the most pronounced effect observed on non-oriented matrices. Thus, we have shown that changing the surface morphology and hydrophilicity of the polymer makes it possible to enhance neuronal cell adhesion.

The work was financially supported by the Russian Science Foundation (grant № 21-13-00321 “Deformational behavior of biodegradable matrices of various types under mechanical loads”).



1. Mikhutkin A.A. et al. Three-Dimensional Reconstruction of a Surface Based on Scanning Electron Microscopy Images // Crystallography Reports. 2014. Vol. 59. P. 908.

2. Yastremsky E.V. et al. Surface modification of biomedical scaffolds by plasma treatment // Crystallography Reports. 2022. Vol. 67. P. 421.

3. Brunauer S. Adsorption of gases and vapors. Izdatinlit, Moscow. 1948.

4. Mikhutkin A.A. et al. Towards Tissue Engineering: 3D Study of Polyamide-6 Scaffolds // BioNanoScience. 2018. Vol. 8. P. 511.

5. Tenchurin T.K. et al. The Performance of Nonwoven PLLA Scaffolds of Different Thickness for Stem Cells Seeding and Implantation // Polymers. 2022. Vol. 14. P. 4352.