Одним из основных клинических проявлений атеросклероза является образование атеросклеротических бляшек (АБ), нестабильность которых, в свою очередь, определяет риск фатальных сердечно-сосудистых событий. В связи с этим, представляется актуальной задачей разработка новых предикторы дестабилизации атером для возможности своевременного обнаружения патологии и начала терапии. Значительную роль в формировании нестабильной АБ играют гипоксические состояния, возникающие в различных отделах сосудов, а также внутрисосудистый гемолиз. Ключевым фактором, приводящим к нарушениям в регуляции кислородного обмена, является отклонение от нормы функциональных параметров эритроцитов. Лимитирующая стадия процесса CO2/O2 обмена в организме связана с работой трансмембранного эритроцитарного белка полосы 3, на функциональных параметрах которого мы и сфокусировали наше внимание. Таким образом, данное исследование с применением сканирующей проточной цитометрии направлено на выявление отклонений эритроцитарных показателей, имеющих отношение к формированию нестабильной атеромы в патогенезе атеросклероза.

Атеросклеротические бляшки брахиоцефальных артерий получали путем эндартерэктомии. Гистологическое исследование микроскопических срезов АБ проводилось с помощью AxioCam MRc5. В экспериментах использовалась донорская венозная кровь. Для предотвращения свертываемости забор крови производился в стандартный пластиковый вакутейнер с антикоагулянтом в соотношении кровь/антикоагулянт 9:1. В качестве антикоагулянта использовалась EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), так как она является стандартом в подобных исследованиях. Всего в это исследование было включено 58 пациентов и 60 доноров. Все добровольцы были разделены на три группы: пациенты со стабильными и нестабильными атеромами и условно здоровые доноры. Процедура измерения состояла в следующем: каждый образец разбавляли в 1000 раз 0,9% физиологическим раствором или раствором для инициации гемолиза. Объем, содержащий 100 мкл разведенной крови, помещали в пробирку и измеряли с помощью сканирующего проточного цитометра (СПЦ производства ООО «ЦитоНова», Новосибирск, Россия, http://cyto.kinetics.nsc.ru).

С использованием сканирующего проточного цитометра были измерены следующие параметры: морфология эритроцитов (диаметр, толщина, объем, площадь поверхности, индекс сферичности и спонтанная кривизна), функциональные свойства эритроцитов (эластичность, анионный обмен) и содержание гемоглобина в единичных клетках. Эти результаты мы анализировали одновременно со стандартными диагностическими параметрами, включающими оценку нарушений липидного обмена и уровня гликированного гемоглобина в крови. Оказалось, что статистически значимое различие (по критерию Манна-Уитни при р-значении = 0.029) между выборками с различными типами атером наблюдается по параметру, отвечающему за устойчивость эритроцитов к индуцированному изотоническому гемолизу. Более того, было зафиксировано, что пациенты со стабильной атеромой имеют более высокую скорость анионного обмена, чем у условно здоровых доноров и у пациентов с нестабильной атеромой.

Обнаруженное поведение эритроцитов при наличии атеросклероза брахиоцефальных артерий можно объяснить компенсаторным эффектом организма в попытке удовлетворить повышенную потребность кислорода в области АБ и устранить гипоксические состояния и, как следствие, рост и дестабилизацию АД.

Background:

One of the main clinical manifestations of atherosclerosis is the formation of atherosclerotic plaques (AP), the instability of which determines the risk of fatal cardiovascular events. It is important to develop new factors of atheroma destabilization that would have predictive value. Hypoxic conditions in different parts of the vessels and intravascular hemolysis play an important role in formation of unstable AP. It regulates by oxygen exchange which is limited by erythrocyte band 3 membrane proteins and erythrocyte structure. This study aims to detect deviations in the erythrocyte parameters which capable of the formation and progression of unstable atheroma in the pathogenesis of atherosclerosis.

Methods: Carotid artery plaques were obtained by endarterectomy. Histological examination of AP microscopic sections by AxioCam MRc5. Blood was drawn by venipuncture and analyzed at room temperature (22 °C). Totally 58 patients and 60 donors were included in this study. All donors were divided in three groups: patients with stable and unstable plaques and healthy donors. Each sample was 1000-fold diluted in 0.9% saline or lysis solution to obtain appropriate cell concentration (0.5∙107÷2∙107) for efficient system operation. Volume containing 100 µl of diluted blood was placed into a testing tube and measured with the scanning flow cytometer (SFC fabricated by CytoNova Ltd., Novosibirsk, Russia, http://cyto.kinetics.nsc.ru).

Results:

We investigated the following parameters: erythrocyte morphology (diameter, thicknesses, volume, surface area, sphericity index and spontaneous curvature), erythrocyte functional membrane properties (elasticity, active and total anion exchangers) and hemoglobin content in individual cells. We combined these results with standard diagnostic parameters, including assessment of lipid metabolism disorders and glycated hemoglobin level in blood. It turns out that a statistically significant difference (according to the Mann-Whitney test with p-value = 0.029) between groups with different types of atheromas is found in the parameter responsible for resistance to induced isotonic hemolysis. Moreover, patients with stable plaque have the higher rate of anion permeability that appears in healthy group or patients with unstable plaque.

Conclusion: Observed erythrocyte behavior can be explain as attempt to satisfy the increased oxygen demand in AP and to eliminate hypoxic conditions, and, as a result, the growth and destabilization of the AP.