Частое, длительное и бесконтрольное применение антибиотиков при лечении инфекций привело к увеличению числа бактериальных штаммов, устойчивых к широкому спектру антибиотиков. Устойчивые к антибиотикам бактерии, такие как Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacter spp., имеют большое значение в случае инфицированных камней мочевыделительной системы. Во время дробления камней бактерии попадают в полость органов и могут вызвать инфекционные осложнения (пиелонефрит, синдром системной воспалительной реакции, уросепсис). Антимикробная фотодинамическая терапия рассматривается как альтернатива антибиотикотерапии в случае локализованных инфекционных процессов. Целью данного исследования являлась оценка эффективности антибактериальной фотодинамической терапии в отношении уропатогенных микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам.

Микроорганизмы выделяли из почечных камней, предварительно отобранных по их рентгенологической плотности. Оценку восприимчивости бактерий к антибиотикам проводили с использованием метода дисковой диффузии. По изменению интенсивности флуоресценции было изучено накопление фотосенсибилизатора Фотодитазин микроорганизмами. Для этого ночную культуру микроорганизмов разводили до 2,5×108 КОЕ/мл в фосфатно-солевом буфере. Затем к бактериям добавляли фотосенсибилизатор, инкубировали в темноте при комнатной температуре и измеряли интенсивности флуоресценции. Для лазерного облучения 100 мкл суспензии бактерий переносили в 96-луночный планшет. Облучение образцов проводили оптоволоконным диодный лазером с длиной волны 662 нм в течение 9 минут с различной выходной мощностью.

Установлено, что 78,7±5,2 % камней было контаминировано. При проверке чувствительности выделенных штаммов к 10 антибиотикам различного механизма действия показано, что данные штаммы обладали выраженной антибиотикорезистентностью. Штаммы Staphylococcus aureus и Enterococcus faecalis были устойчивы ко всем исследуемым препаратам (0 чувствительных из 10). Escherichia coli обладала чувствительностью к нитрофуралу (1 из 10 чувствительных), а Proteus mirabilis имел промежуточную чувствительность к офлоксацину и нитрофуралу (2 промежуточных из 10). Исследование взаимодействия фотосенсибилизатора с микроорганизмами показало, что накопление фотосенсибилизатора зависело как от времени инкубации, так и от концентрации. Поскольку образцы были отмыты от несвязавшихся молекул фотосенсибилизатора, следовательно, флуоресценция обусловлена фотосенсибилизатором, который проник в клетки и/или связался с клеточной стенкой. Установлено, что интенсивность флуоресценции у грамотрицательных штаммов выше, чем у грамположительных, независимо от концентрации фотосенсибилизатора. Штаммы E. faecalis и S. aureus демонстрировали усиление интенсивности флуоресценции в зависимости от времени с максимальными значениями через 60 мин. E. coli и P. mirabilis имели максимальное значение интенсивности флуоресценции через 30 мин и достоверно снижались к 60 мин. Установлено, что оптимальное время инкубации составляет 30 минут. Однако разрабатываемую методику планируется использовать во время литотрипсии, когда временной интервал ограничен; поэтому была выбрана инкубации в течение 15 мин. В дальнейшем использовали концентрацию фотосенсибилизатора 50 мкг/мл. После инкубации в темноте в течение 15 мин и последующих манипуляций (разведение, посев) при естественном освещении S. aureus и E. faecalis не давали роста колоний на чашках. Воздействие только лазерного излучения на грамположительные и грамотрицательные бактерии не вызывала снижения КОЕ. Выживаемость P. mirabilis при фотодинамической инактивации зависела от мощности. Количество жизнеспособных бактерий снижалось с 65% до 10% при увеличении мощности с 50 мВт до 150 мВт, а максимальный бактерицидный эффект достигался при 150 мВт.

Далее проводили оптимизацию методики антимикробной фотодинамической терапии для грамотрицательных видов. Эффективность аФДТ отмытых от несвязанного фотосенсибилизатора E. coli составила всего 5%. Добавление Твин 80 позволило незначительно повысить эффективности аФДТ до 9%. Эффективность аФДТ E. coli, инкубированных с фотосенсибилизатором и Тритоном Х-100, достигла 52,5%. Установлено, что удаление фотосенсибилизатора из внеклеточной жидкости приводит к потере эффективности аФДТ. K. pneumoniae не обладала чувствительностью к аФДТ при отсутствии внеклеточного фотосенсибилизатора, тогда как в его присутствии составляла 89%. E. coli обладала низкой чувствительностью к аФДТ не зависимо от наличия фотосенсибилизатора во внеклеточной жидкости. P. aeruginosa имела высокую чувствительность к аФДТ при наличии внеклеточного фотосенсибилизатора, которая значительно снижалась при его отмывке. Эффективность аФДТ P. mirabilis после отмывки внеклеточного фотосенсибилизатора не изменилась. Показано, что эффективность аФДТ зависела от мощности лазера у всех исследованных видов, за исключением K. pneumoniae. Эффективность аФДТ К. pneumoniae не превышала 93%. При облучении других видов бактерий с мощностью 450 мВт эффективность аФДТ составляла 99,99%. Для проверки эффективности разработанной методики аФДТ образцы инфицированной мочи пациентов инкубировали с фотосенсибилизатором и Тритоном Х-100 в течение 15 минут в темноте. Затем, не удаляя фотосенсибилизатор, облучали лазером с выходной мощностью 450 мВт. Эффективность аФДТ инфицированных культур мочи составила не менее 99,996%.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, проект №21-15-00371

The frequent, prolonged, and uncontrolled use of antibiotics in the treatment of infections has resulted in an increasing number of bacterial strains resistant to a wide range of antibiotics. The antibiotic resistant bacteria such as Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Enterobacter species are of great significance in the case of infected urinary stones. During lithotripsy pathogens may diffuse in organ cavity and induce postoperative complications, such as pyelonephritis, systemic inflammatory reaction syndrome, and urosepsis. Antimicrobial photodynamic therapy is considered to be an alternative to the antibiotic treatment of localized infectious processes. The purpose of the study was to evaluate the antibacterial efficacy of photodynamic inactivation against human antibiotic-resistant bacterial uropathogens.

Uropathological microorganisms were isolated from renal calculi preliminary selected based on their X-ray density. The disk diffusion susceptibility method was used according to the approved standard. The accumulation of photosensitizer, Fotoditazin, by microorganisms was studied. The overnight culture of microorganisms were diluted to 2.5x108 CFU/mL in a phosphate buffer saline. The photosensitizer was added to the bacteria with subsequent incubation for 15 min in the dark at room temperature. For laser irradiation 100 ul of the bacteria suspension were transferred into a 96-well plate. The fiber-coupled diode laser with a wavelength of 662 nm was used to illuminate samples. Laser irradiation was performed for 9 minutes and various output power.

It was found that 78.7±5.2 % of renal calculi were contaminated. Testing the sensitivity of the isolated strains to 10 antibiotics of different mechanisms of action showed that the studied strains have a high antibiotic resistance. Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis strains were shown to be resistant to all the tested drugs (0 sensitive out of 10). It was found that Escherichia coli was susceptible to nitrofural (1 sensitive out of 10) and Proteus mirabilis had intermediate sensitivity to ofloxacin and nitrofural (2 intermediate out of 10). The interaction between photosensitizer and urapothogenic microorganisms was analyzed. Since the samples were washed from free molecules of photosensitizer, the fluorescence was only detected from the photosensitizer that had penetrated into cells and/or was bound with cell wall. The photosensitizer accumulation was estimated to be dependent on both incubation time and concentration. The fluorescence intensity was found to be higher for Gram-negative strains than for the Gram-positive ones regardless of the photosensitizer concentration. The strains of E. faecalis and S. aureus demonstrated the enhancement of the fluorescence intensity in a time-dependent manner with the maximal value at 60 min. E. coli and P. mirabilis had the maximal value of fluorescence intensity after 30 min and that significantly decreased by 60 min. The optimal incubation time was found to be 30 minutes. However, this technique is planning to use during laser lithotripsy for sanitation, where the time is a limiting factor; therefore, 15 min of incubation was chosen. The concentration of the photosensitizer was selected to be 50 µg/mL. After 15 minutes of incubation in the dark followed by 15 minutes of manipulation (dilution, inoculation) at ambient light, no colony of S. aureus and E. faecalis was detected on the plates. The treatment of either Gram-positive or Gram-negative bacteria by laser light only did not induce significant reduction of CFUs. The survival rate of P. mirabilis for photodynamic inactivation was power-dependent. The number of viable bacteria was decreasing from 65% to 10% with an increase in power from 50 mW to 150 mW. The maximal bactericidal effect was reached at 150 mW.

Next, the antimicrobial photodynamic therapy was adapted for Gram-negative species. The efficacy of aPDT of E. coli washed from an unbound photosensitizer under continuous wave irradiation was only 5%. Tween 80 provided an insignificant enhancement of aPDT efficacy of up to 9%. The efficacy of aPDT of E. coli incubated with photosensitizer and Triton X-100 achieved 52.5%. It was found that washing of the extracellular photosensitizer led to loss of the aPDT efficacy. K. pneumoniae was not sensitive to aPDT without extracellular photosensitizer, while the efficacy of aPDT with the photosensitizer was 89%. E. coli had low sensitivity to aPDT without extracellular photosensitizer as well as with it. The high sensitivity of P. aeruginosa to aPDT with extracellular photosensitizer significantly reduced after washing of the photosensitizer. The efficacy of aPDT of P. mirabilis did not change after washing of the extracellular photosensitizer. It was demonstrated that the aPDT efficacy depended on laser power in all studied species, excluded K. pneumoniae. The efficacy of K. pneumoniae treatment did not exceed 93%. The irradiation of other bacteria species with a power of 450 mW provided an aPDT efficacy of 99.99%. To test the efficacy of the developed aPDT technique, urine cultures of the patients were incubated with a photosensitizer and Triton X-100 for 15 minutes in the dark. Then, the unwashed samples were illuminated by a continuous wave laser at 450 mW of output power. The efficacy of the aPDT of infected urine cultures was not less than 99.996%.

This work was supported by the Russian Science Foundation, project №21-15-00371