Изучение фундаментальных и прикладных основ функционирования мозга входит в число приоритетных направлений современной науки. Исследования in vivo позволяют получать данные о прижизненной активности нейронной сети, которая представляет собой совокупность нейронов и других типов клеток, связанных между собой и выполняющих специфические физиологические функции. Нейронные сети обеспечивают сложную и высокоорганизованную работу головного мозга, а ее активность влияет как на ментальные, так и на физические стороны человеческой жизни. При этом важные результаты, полученные в ходе исследований головного мозга, в настоящий момент являются неполными, так как они были получены in vitro или ex vivo, поэтому исследование головного мозга in vivo является важной задачей современной нейробиологии.



В данном проекте мы разработали и изготовили микроэлектрод, который позволит объединить методы прижизненной кальциевой визуализации с помощью миниатюрного флуоресцентного микроскопа (минископа) и электрофизиологической регистрации.



Визуализация нейрональной активности in vivo может быть осуществлена при помощи специальных сенсоров, флуоресцирующих при изменении концентрации различных ионов, например, кальция. Семейство генетически кодируемых индикаторов кальция GCaMP (который представляет собой гибрид зеленого флуоресцентного белка (GFP), кальмодулина (CaM) и M13 (пептидной последовательности киназы легкой цепи миозина)) широко представлено в научной практике и часто используется в исследованиях нейронной активности. Кальциевая сигнализация связывает мембранную возбудимость и клеточные биологические функции, она играет важную роль в визуализации активности нейронов [1,2]. Метод кальциевой визуализации дает возможность понять функциональные взаимосвязи путем регистрации больших популяций нейронов [3,4].



Технология прижизненной кальциевой визуализации с помощью однофотонного миниатюрного флуоресцентного микроскопа (минископа) является важным современным инструментом для исследования нейронных сетей в различных областях мозга. Использование минископа позволяет регистрировать нейронную активность на свободно передвигающихся лабораторных животных, в отличие от традиционно применяемой двухфотонной визуализации.



Тем не менее, достижимое временное разрешение ограничено медленной (миллисекундной) кинетикой связывания Ca2+, поскольку генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы Ca2+ на основе кальмодулина всегда демонстрируют увеличенное время затухания флуоресценции. Другими словами, регистрация высокочастотных потенциалов действия может быть ограничена динамикой кальциевого сенсора. Поэтому кальциевая визуализация in vivo не отражает всю активность нейронных сетей, что негативно сказывается на понимании механизмов, лежащих в основе формирования памяти, обучения, сна, социального поведения, питания, а также процессов, лежащих в основе их нарушения [5,6]. Одним из возможных путей решения данной проблемы является совмещение электрофизиологической регистрации и оптической визуализации. Для этого в данной работе мы спроектировали и изготовили микроэлектрод, адаптированный под размеры градиентной линзы и совмещенный с ней.



Данный микроэлектрод представляет собой трехслойную структуру прямоугольной формы из полиимидной пленки и контактных/токопроводящих дорожек из золота, нанесенных методом термоформовки. На одной из сторон пленки расположены 12 открытых токопроводящих контактов для регистрации локальных полевых потенциалов, а на другой стороне аналогичное количество токопроводящих дорожек для подключения коннектора, осуществляющего передачу данных на плату обработки.



Разработанный микроэлектрод позволит объединить методы прижизненной кальциевой визуализации с помощью минископа и электрофизиологической регистрации. Такой подход даст возможность более детально исследовать активность нейронных сетей, а также картировать мозг свободно движущихся лабораторных животных с высоким пространственно-временным разрешением, что расширит возможности исследований в области нейробиологии.



Целью нашей дальнейшей работы будет анализ активности нейронов гиппокампа на основе данных миниатюрной флуоресцентной микроскопии и параллельной регистрации локального полевого потенциала за счет разработанного микроэлектрода у лабораторных мышей дикого типа и с моделью болезни Альцгеймера во время оценки условно-рефлекторного замирания. Данное исследование позволит выявить нарушения при болезни Альцгеймера на уровне нейронных сетей и как следствие предположить потенциально новые методы лечения или механизмы развития патологии, связанной с прогрессирующей потерей памяти при болезни Альцгеймера.



Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 22-75-00028 (АИЕ).



Список литературы

1. Berridge, M.J., Neuronal calcium signaling. Neuron. 1998. 21: p. 13-26.

2. Bezprozvanny, I.B. and Mattson, M.P., Neuronal calcium mishandling and the pathogenesis of Alzheimer's disease. Trends Neurosci. 2008. 31: p. 454-63.

3. Timko, B.P., et al., Electrical recording from hearts with flexible nanowire device arrays. Nano Lett. 2009. 9: p. 914–918.

4. Khodagholy, D., et al., Highly conformable conducting polymer electrodes for in vivo recordings. Adv. Mater. 2011. 23: p. 268–272.

5. Cai, D.J., et al., A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 2016. 533: p. 115-8.

6. de Groot, A., et al., NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 2020. 9.

The study of fundamental and applied bases of brain functioning is among the priority areas of modern science. In vivo studies provide data on the lifetime activity of the neural network, which is a set of neurons and other cell types interconnected and performing specific physiological functions. Neural networks provide complex and highly organized work of the brain, and its activity affects both mental and physical aspects of human life. That said, important results obtained in brain research are currently incomplete, as they have been obtained in vitro or ex vivo, so in vivo brain research is an important task of modern neurobiology.



In this project, we have designed and fabricated a microelectrode that will allow us to combine methods of lifetime calcium imaging using a miniature fluorescence microscope (miniscope) and electrophysiological registration.



In vivo visualization of neuronal activity can be performed using special sensors that fluoresce when the concentration of various ions, such as calcium, changes. The family of genetically encoded calcium indicators GCaMP (which is a hybrid of green fluorescent protein (GFP), calmodulin (CaM) and M13 (myosin light chain kinase peptide sequence)) is widely presented in scientific practice and often used in studies of neuronal activity. Calcium signaling links membrane excitability and cellular biological functions and plays an important role in imaging neuronal activity [1,2]. Calcium imaging technique provides an opportunity to understand functional relationships by recording large populations of neurons [3,4].



The technology of lifetime calcium imaging using a single-photon miniature fluorescence microscope (miniscope) is an important modern tool for studying neuronal networks in various brain regions. The use of the miniscope makes it possible to record neuronal activity on freely moving laboratory animals, in contrast to the traditionally used two-photon imaging.



However, the achievable temporal resolution is limited by the slow (millisecond) kinetics of Ca2+ binding, because genetically encoded calmodulin-based Ca2+ fluorescent indicators always exhibit an extended fluorescence attenuation time. In other words, registration of high-frequency action potentials may be limited by the dynamics of the calcium sensor. Therefore, calcium imaging in vivo does not reflect the entire activity of neuronal networks, which negatively affects the understanding of the mechanisms underlying memory formation, learning, sleep, social behavior, feeding, as well as the processes underlying their disruption [5,6]. One possible way to solve this problem is to combine electrophysiological registration and optical imaging. For this purpose, in this work we designed and manufactured a microelectrode adapted to the size of the gradient lens and combined with it.



This microelectrode is a three-layer rectangular structure of polyimide film and thermoformed gold contact/conducting tracks. On one side of the film are 12 open conductive contacts for recording local field potentials, and on the other side a similar number of conductive tracks for connecting a connector that transmits data to the processing board.



The developed microelectrode will allow combining the methods of in vivo calcium imaging using a miniscope and electrophysiological registration. This approach will enable a more detailed study of the activity of neural networks, as well as mapping the brains of freely moving laboratory animals with high spatial and temporal resolution, which will expand the possibilities of research in the field of neurobiology.



The aim of our future work will be to analyze the activity of hippocampal neurons based on miniature fluorescence microscopy data and parallel recording of the local field potential due to the developed microelectrode in wild-type laboratory mice and with an Alzheimer disease model during the evaluation of conditionally-reflexive freezing. This study will reveal abnormalities in Alzheimer's disease at the neural network level and, as a consequence, suggest potentially new therapies or mechanisms of pathology associated with progressive memory loss in Alzheimer's disease.



This research was funded by the Russian Science Foundation grant no. 22-75-00028 (A.I.E.)



References

1. Berridge, M.J., Neuronal calcium signaling. Neuron. 1998. 21: p. 13-26.

2. Bezprozvanny, I.B. and Mattson, M.P., Neuronal calcium mishandling and the pathogenesis of Alzheimer's disease. Trends Neurosci. 2008. 31: p. 454-63.

3. Timko, B.P., et al., Electrical recording from hearts with flexible nanowire device arrays. Nano Lett. 2009. 9: p. 914–918.

4. Khodagholy, D., et al., Highly conformable conducting polymer electrodes for in vivo recordings. Adv. Mater. 2011. 23: p. 268–272.

5. Cai, D.J., et al., A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 2016. 533: p. 115-8.

6. de Groot, A., et al., NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 2020. 9.