Дисфункция митохондрий и митохондриального (мт) генома часто является причиной не только заболеваний, но и старения. С возрастом происходит снижение общего количества митохондрий, нарушение их внутренней структуры, снижается общее количество мтДНК, накапливаются различные повреждения мтДНК. Изучение механизмов стабилизации мт генома представляет несомненный научный и практический интерес. Хорошей моделью являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae, для которых даже удаление мтДНК (rho0 мутанты) не является гибельным. В своих исследованиях мы используем штаммы производные от коллекционного штамма Х2180-1А (референсный дрожжевой штамм S288c также является его производным). Этот штамм характеризуется высокой частотой мт делеционных мутаций дыхательной недостаточности (petite, rho-). Генетический анализ показал, что высокая rho-- мутабильность обусловлена одновременным присутствием не менее 5 генов, каждый из которых вызывает лишь относительно слабое повышение спонтанной rho--мутабильности (Devin, Koltovaya, 1987). В дальнейшем полногеномное секвенирование выявило четыре дефектные аллеля генов MIP1, SAL1, CAT5 и MKT1, обуславливающих высокую мт мутабильность (Dimitrov et al., 2009). Эти гены кодируют мтДНК-полимеразу, мт АТФ/АДФ-транспортер, мт монооксидазу, участвующую в синтезе убихинона и ДНК эндонуклеазу. Мутации имеют аддитивный эффект и в сумме приводят к высокой частоте petites. На фоне повышенной мт мутабильности нам удалось выделить несколько ядерных мутаций srm (spontaneous rho--mutability), понижающих мутагенез и стабилизирующих мт геном (Devin et al., 1990; Koltovaya et al., 2003). При этом каждая из мутаций srm супрессировала общий аддитивный эффект mip1, sal1, cat5 и mkt1. Три из мутаций srm локализованы в генах SRM5/CDC28-CDK1, SRM12/HFI1-SAGA и SRM8/NET1 (Sir2), кодирующих субъединицы комплексов, отвечающих за фосфорилирование, ацетилирование и деацетилирование. Для оставшихся двух мутаций, srm1 и srm2, проводится идентификация. Полногеномное секвенирование позволило определить предварительных кандидатов SRM1/TOP2 (топоизомераза) и SRM2/HUL4 (убиквитин-лигаза).

Используя метод амплификации ПЦР–РТ провели анализ копийности мтДНК. Из пяти проанализированных мутантов у всех кроме одного (srm1), копийность мтДНК возросла примерно в два раза. Таким образом, стабилизация мт генома произошла на фоне повышения копийности мтДНК.

Анализ хронологического старения показал, что srm1 не влияет на время жизни, srm2 повышает жизнеспособность, а srm5, srm8 и srm12 снижают время жизни стационарных культур по сравнению с исходной культурой. Известно, что мутация ada1/srm12 ускоряет и репликативное старение (Sinclair et al., 1997). Однако удаление мтДНК (rho0 мутации) приводило к повышению продолжительности жизни клеток SRM, srm2 и srm5, но сильно снижало у клеток srm1, srm8 и srm12. Таким образом, на фоне стабилизации мт генома может происходить как ускорение хронологического старения, так и замедление. Основной причиной хронологического старения является накопление в среде продукта метаболизма дрожжей — уксусной кислоты, которая индуцирует апоптотическую гибель клеток. Действительно, при обработке перекисью, которая также индуцирует апоптоз, картинка для rho+ клеток совпадает, однако для rho0 мутантов расходятся, по-видимому, влияние мутаций srm на старение для rho+ и rho0 различается.

Старение клеток сопровождается усилением образования активных форм кислорода (АФК), которые, в свою очередь, активируют апоптотический путь, приводящий к гибели клеток. Уровень АФК может оказывать влияние также на копийность мтДНК. Провели оценку влияния мутаций srm на оксидативную активность штаммов с помощью жидкостной цитометрии и специализированных красителей АФК (H2DCFDA, DHR123, DHE). Используемые нами штаммы получили от исходного штамма Х2180-1А мутацию hap1, нарушающую работу транскрипционного фактора, регулирующего кислородный ответ, а именно синтез дыхательных ферментов, гема, эргостерола и белков, участвующих в окислительном стрессе (Kwast et al., 1998). Кстати, hap1 слабо повышает частоту petites (HAP1 - 2.8%, hap1 - 5.8%). hap1 вызывает снижение синтеза всех цитохромов (аа3, b, c+c1) и накопление пигмента Zn-порфирина. Дисбаланс дыхания может повышать уровень АФК. У используемых hap1 штаммов снижен синтез эргостерола и антиоксидантных ферментов, в том числе цитоплазматической каталазы Ctt1, супероксид дисмутазы Sod2 и флавогемоглобина Yhb1 что может вызывать повышение проницаемости мембран и уровень АФК. Накопление Zn-порфирина, максимум флуоресценции которого наблюдается при 585 и 540 нм, влияет на автофлуоресценцию. На этом сложном биохимическом фоне эксперименты показали, что srm2, srm8 и srm12 понижают автофлуоресценцию. При окраске красителями максимумы флуоресценции слегка смещаются, что свидетельствует о низком уровне АФК. Однако при обработке перекисью мутант srm1 характеризуется более высокой концентрацией перекиси в цитоплазме и митохондриях, а srm5 - пониженной. На фоне rho0 высокий уровень перекиси в митохондриях у srm1 и srm8, и низкий уровень у srm2 и srm12. Таким образом, на фоне повышения концентрации перекиси в клетках в результате различных механизмов наблюдается разнонаправленное действие мутаций srm. Для понимания процессов, в которых участвуют гены SRM необходимы дополнительные исследования. В дальнейшем планируется провести анализ транскриптома клеток, синтеза каталазы и супероксид дисмутазы, длины теломер, а также напрямую тестировать с помощью флуоресцентных красителей апоптоз (AnnexinV-FITC/PI) и мембранный потенциал (JC-1 и Rh123).

Dysfunction of mitochondria and the mitochondrial (mt) genome is often the cause of not only disease, but also aging. With age, there is a decrease in the total number of mitochondria, a violation of their internal structure, a decrease in the total amount of mtDNA, and various mtDNA damage accumulates. The study of the mechanisms of stabilization of the mt genome is of undoubted scientific and practical interest. A good model is the yeast Saccharomyces cerevisiae, for which even deletion of mtDNA (rho0 mutants) is not fatal. In our studies, we use strains derived from the collection strain X2180-1A (the reference yeast strain S288c is also its derivative). This strain is characterized by a high frequency of mt deletion mutations in respiratory deficiency (petite, rho-). Genetic analysis showed that high rho-- mutability is due to the simultaneous presence of at least five genes, each of which causes only a relatively weak increase in spontaneous rho--mutability (Devin, Koltovaya, 1987). Subsequently, whole genome sequencing revealed four defective alleles of the MIP1, SAL1, CAT5, and MKT1 genes, which are responsible for high mt mutability (Dimitrov et al., 2009). These genes encode mtDNA polymerase, an ATP/ADP mt transporter, mt monooxidase, and DNA endonuclease. The mutations have an additive effect and add up to a high frequency of petites. On the background of increased mt mutability, we were able to isolate several srm (spontaneous rho--mutability) nuclear mutations that decrease mutagenesis and stabilize the mt genome (Devin et al., 1990; Koltovaya et al., 2003). Each of the srm mutations suppressed the overall additive effect of four defective alleles. Three of the srm mutations are localized in the SRM5/CDC28-CDK1, SRM12/HFI1-SAGA, and SRM8/NET1 (Sir2) genes encoding subunits of complexes responsible for phosphorylation, acetylation, and deacetylation. The remaining two mutations, srm1 and srm2, are being identified. Whole genome sequencing allowed the identification of preliminary candidates SRM1/TOP2 (topoisomerase) and SRM2/HUL4 (ubiquitin ligase).

Using the PCR–RT amplification method, we analyzed the copy number of mtDNA. Of the five analyzed mutants, in all but one (srm1), the copy number of mt DNA increased approximately twofold. Thus, stabilization of the mt genome occurred on the background of an increase in the copy number of mtDNA.

Analysis of chronological aging showed that srm1 did not affect, srm2 increased, and srm5, srm8 and srm12 reduced the lifespane of stationary cultures compared to the initial culture. It is known that the ada1/srm12 mutation also accelerates replicative aging (Sinclair et al., 1997). However, deletion of mtDNA (rho0-mutations) led to an increase in the lifespan of SRM, srm2, and srm5 cells, but significantly reduced the lifespan of srm1, srm8, and srm12 cells. Thus, against the background of stabilization of the mt genome, both increasing and decreasing of lifespane can occur. The main cause of chronological aging is the accumulation of acetic acid in the medium, a product of yeast metabolism, which induces apoptotic cell death. Indeed, upon treatment with peroxide, which also induces apoptosis, the picture for rho+ cells is the same, but for rho0 mutants they diverge, apparently, the effect of srm mutations on aging for rho+ and rho0 is different.

Yeast aging is accompanied by increased formation of reactive oxygen species (ROS), which, in turn, activate the apoptotic pathway leading to cell death. The level of ROS may also affect the copy number of mtDNA. We assessed the effect of srm mutations on the oxidative activity of strains using flow cytometry and specialized ROS dyes (H2DCFDA, DHR123, DHE). The strains used by us obtained the hap1 mutation from the original X2180-1A strain, which disrupts the functioning of the transcription factor that regulates the oxygen response, namely, the synthesis of respiratory enzymes, heme, ergosterol, and proteins involved in oxidative stress (Kwast et al., 1998). By the way, hap1 slightly increases the frequency of petites (HAP1 - 2.8%, hap1 - 5.8%). hap1 causes a decrease in the synthesis of all cytochromes (аа3, b, c+c1) and accumulation of the Zn-porphyrin pigment. Respiration imbalance can increase ROS levels. The hap1 strains used have reduced synthesis of ergosterol and antioxidant enzymes, including cytoplasmic catalase Ctt1, superoxide dismutase Sod2, and flavohemoglobin Yhb1, which can increase membrane permeability and ROS levels. The accumulation of Zn-porphyrin, whose fluorescence maximum is observed at 585 and 540 nm, affects autofluorescence. On this complex biochemical background, experiments have shown that srm2, srm8, and srm12 reduce autofluorescence. When stained, the fluorescence maxima are slightly shifted, which indicates a low level of ROS. However, upon treatment with peroxide, the srm1 mutant is characterized by a higher peroxide concentration in the cytoplasm and mitochondria, while srm5 is lower. On the background of rho0, the level of peroxide in mitochondria is high in srm1 and srm8, and low in srm2 and srm12. Thus, against the background of an increase in the concentration of peroxide in cells as a result of various mechanisms, a multidirectional effect of srm mutations is observed. More research is needed to understand the processes in which the SRM genes are involved. In the future, it is planned to analyze the cell transcriptome, catalase and superoxide dismutase synthesis, telomere length, as well as directly test apoptosis (AnnexinV-FITC/PI) and membrane potential (JC-1 and Rh123) using fluorescent dyes.