При изучении внутриклеточных взаимодействий биоактивных молекул с белками-мишенями, часто возникает задача определения концентраций данных молекул в клетке. Особый интерес при этом представляет концентрация только тех молекул, которые способны взаимодействовать с белком-мишенью, т.е. эффективная их концентрация. В цитоплазме она может довольно существенно отличаться от средней концентрации, например, за счет того, что биоактивная молекула и белок-мишень могут находиться в разных клеточных компартментах. Для определения эффективной концентрации нами был разработан подход, основанный на обработке данных клеточного анализа теплового сдвига с помощью простой равновесной математической модели взаимодействия между молекулами. Этот подход был проверен на примере белковых конструкций, способных взаимодействовать с белком Keap1, приводя, тем самым к высвобождению транскрипционного фактора Nrf2 из комплекса с Keap1.

В нашей лаборатории активно разрабатываются полипептидные модульные системы доставки биоактивных молекул, которые способны связываться с выбранным рецептором на поверхности клеток-мишеней, интернализоваться в клетки путем эндоцитоза и выходить из эндосом. В настоящей работе осуществляется доставка антителоподобной молекулы – монободи R1 к белку Keap1. Для связывания с клетками и последующей интернализации использовалась другая антителоподобная молекула – аффибоди к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR). За выход из эндосом отвечал транслокационный домен дифтерийного токсина (ДТокс). Гемоглобиноподобный белок E.coli соединял все модули вместе и придавал конструкции необходимую растворимость. Такой модульный нанотранспортер в дальнейшем обозначен МНТ, а контрольная конструкция без монободи к Keap1 – МНТк.

Интернализация МНТ, меченного флуоресцентным красителем, изучалась с помощью метода проточной цитофлуориметрии на клетках печени мыши (alpha mouse liver 12, AML12). Уже через 15 минут инкубации клеток AML12 с МНТ флуоресценция клеток достоверно возрастает по сравнению с контролем без добавления МНТ. Показано, что интернализация в большей мере обусловлена взаимодействием МНТ с EGFR, а не неспецифическим связыванием с клетками.

Способность ДТокс в составе МНТ вызывать pH-зависимое нарушение целостности липидных мембран исследовали по выходу флуоресцентного красителя кальцеина из фосфатидилхолиновых липосом, нагруженных кальцеином в концентрации, приводящей к самотушению флуоресценции. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ДТокс сохраняет свою активность в полученном МНТ, что видно по наличию пика мембранолитической активности при значении рН 5,5.

Способность монободи R1 в составе МНТ взаимодействовать с Keap1 в растворе была проверена с помощью метода термофореза. Было показано, что константа диссоциации комплекса МНТ с Keap1 составляет 8 ± 3 нМ, т.е. это взаимодействие является высокоаффинным. Учитывая, что сродство свободного монободи к Keap1 значительно выше, чем монободи в составе МНТ, отщепление данного монободи в эндосомах будет способствовать его взаимодействию с Keap1 в клетках.

Доказательство взаимодействия МНТ с Keap1 в клетках было получено с помощью метода резонансного переноса энергии по Фёрстеру с использованием микроскопии времени жизни флуоресценции. Сущность этого метода заключается в том, что время жизни донора существенно уменьшается, если молекула акцептора находится на расстоянии не больше, чем 10 нм. Клетки AML12 были трансформированы белком Keap1, слитым с зеленым флуоресцентным белком (eGFP). А МНТ и МНТк были помечены флуоресцентным красителем AlexaFluor568. После 1 часа инкубации клеток с МНТ, но не с МНТк, наблюдается достоверное уменьшение среднего времени жизни флуоресценции eGFP.

Количественно описать взаимодействие МНТ с Keap1 и последующее вытеснение Nrf2 из комплекса с Keap1 можно с помощью клеточного анализа теплового сдвига. Этот метод позволяет определить так называемую кривую плавления выбранного белка, которая зависит от образования данным белком комплекса с другой молекулой. Таким образом, с помощью иммуноблота, например, с антителами на Nrf2 можно получить долю свободного Nrf2 при разных временах инкубации клеток с МНТ. Используя эту долю и простую равновесную модель конкурентного взаимодействия МНТ с Nrf2-системой, можно оценить концентрацию МНТ в цитоплазме клеток. С помощью предложенного нами подхода были оценены концентрации в цитоплазме Nrf2, Keap1 и МНТ для нескольких линий клеток и полученные результаты хорошо совпадают с данными иммуноблота, выполненными с антителами на выбранный белок и соответствующими калибровочными зависимостями.

Для повышения эффективности МНТ в его состав был введен сайт отщепления монободи R1 эндосомной протеазой катепсином В. Применение предложенного нами подхода для такого МНТ показало существенное возрастание его эффективности, как за счет того, что свободное монободи имеет большее сродство к Keap1, по сравнению с монободи в составе МНТ, так и за счет увеличения доли монободи, вышедших из эндосом.

Таким образом, нами был предложен новый подход для оценки эффективной внутриклеточной концентрации биоактивной молекулы, способной взаимодействовать с выбранным белком-мишенью. Данный подход был использован для оценки концентрации модульных нанотранспортеров, способных взаимодействовать с белком Keap1 и приводить к вытеснению транскрипционного фактора Nrf2 из комплекса с Keap1.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 22-24-00035).

When studying intracellular interactions of bioactive molecules with target proteins, the problem of determining the concentrations of these molecules in a cell often arises. Of particular interest in this case is the concentration of only those molecules that are able to interact with the target protein, i.e., their effective concentration. In the cytoplasm, it can differ significantly from the average concentration, for example, due to the fact that the bioactive molecule and the target protein can be spatially separated, for example, in different cellular compartments. To determine the effective concentration, we developed an approach based on the processing of data from cellular thermal shift assay using a simple equilibrium mathematical model of interaction between molecules. This approach was tested on the example of protein constructs capable of interacting with the Keap1 protein, thereby leading to the release of the transcription factor Nrf2 from the complex with Keap1.

Our laboratory is actively developing polypeptide modular delivery systems for bioactive molecules that can bind to a selected receptor on the surface of target cells, internalize into cells by endocytosis, and exit endosomes. In this work, an antibody-like molecule, the R1 monobody, is delivered to the Keap1 protein. For binding to cells and subsequent internalization, another antibody-like molecule, affibody to the epidermal growth factor receptor (EGFR), was used. The translocation domain of diphtheria toxin (DTox) was responsible for the exit from endosomes. The E.coli hemoglobin-like protein connected all the modules together and gave the construct the necessary solubility. Such a modular nanotransporter is further designated as MNT, while the similar one lacking Keap1 monobody is designated as MNTc.

Internalization of MNT labeled with a fluorescent dye was studied using flow cytometry on mouse liver cells (alpha mouse liver 12, AML12). Just after 15 minutes incubation of AML12 cells with MNT, the fluorescence of the cells significantly increased compared to the control without the addition of MNT. It has been shown that internalization is mainly provided by the interaction of MNT with EGFR, rather than by nonspecific binding to cells.

The ability of DTox within the MNT to cause pH-dependent damage to the integrity of lipid membranes was studied by the release of the fluorescent dye calcein from phosphatidylcholine liposomes loaded with calcein at a fluorescence self-quenching concentration. The obtained results indicate that DTox retains its activity in the obtained MNT, which is evident from the presence of a peak of membranolytic activity at a pH value of 5.5.

The ability of R1 monobody in MNT to interact with Keap1 in solution was tested using the thermophoresis method. It was shown that the dissociation constant of the MNT complex with Keap1 is 8 ± 3 nM, i.e., this interaction is highly affine. Given that the affinity of the free monobody for Keap1 is much higher than that of the monobody in MNT, cleavage of this monobody in endosomes will facilitate its interaction with Keap1 in cells.

Evidence for the interaction of MNT with Keap1 in cells was obtained using the Förster resonant energy transfer method using fluorescence lifetime microscopy. The essence of this method is that the lifetime of the donor is significantly reduced if the acceptor molecule is located at a distance of no more than 10 nm. AML12 cells were transformed with Keap1 protein fused to green fluorescent protein (eGFP), while MNT and MNTc were labeled with the fluorescent dye AlexaFluor568. After 1 hour incubation of cells with MNT, but not MNTc, a significant decrease in the average lifetime of eGFP fluorescence is observed.

The interaction of MNT with Keap1 and the subsequent displacement of Nrf2 from the complex with Keap1 can be quantitatively described using cellular thermal shift assay. This method allows one to determine the so-called melting curve of the selected protein, which depends on the formation of its complex with another molecule. Thus, using Western blot, for example, with antibodies to Nrf2, it is possible to estimate the free Nrf2 fraction following different times of incubation of cells with MNT. Using this fraction and a simple equilibrium model of the competitive interaction of MNT with the Nrf2 system, one can estimate the concentration of MNT in the cell cytoplasm. Using our approach, we estimated the Nrf2, Keap1, and MNT cytoplasmic concentrations in several cell lines, and these results are similar to data obtained by Western blot with antibodies to the selected protein and the corresponding calibration dependences.

To increase its efficiency endosomal protease cathepsin B cleavage site was introduced into MNT between monobody and the rest of MNT molecule. The use of our proposed approach for such a modified MNT showed a significant increase in its efficiency, both due to the fact that the free monobody has a higher affinity for Keap1 compared to the monobody within MNT, and due to an increase in the proportion of monobody released from endosomes.

Thus, we have proposed a new approach for assessing the effective intracellular concentration of a bioactive molecule capable of interacting with a selected target protein. This approach was used to estimate the concentration of modular nanotransporters capable of interacting with the Keap1 protein and leading to the displacement of the transcription factor Nrf2 from the complex with Keap1.

The research was supported by the grant 22-24-00035 of the Russian Science Foundation.