Травмы головного и спинного мозга являются одной из ведущих причин смерти и инвалидности во всем мире. Белок предшественник бета-амилоида (APP, amyloid precursor protein) интенсивно изучается с 1980-х годов из-за его центральной роли в развитии болезни Альцгеймера (AD). APP участвует в развитии, дифференцировке и функционировании нейронов, росте нейритов, формировании синапсов и долговременной памяти, поддержании целостности мозга и реакциях нейронов на повреждения. Однако конкретные биохимические и физиологические функции APP и продуктов его протеолитического расщепления до сих пор неизвестны. Накопление APP в поврежденных нейронах после повреждения периферических нервов указывает на его важную роль в патологических процессах в нервной ткани, вызванных аксотомией.

Цель работы. В этом работе мы исследовали экспрессию и локализацию APP в ганглиях дорзальных корешков (DRG) спинного мозга крысы после перерезки седалищного нерва. Мы изучили экспрессию и локализацию α-секретазы ADAM10, β-секретазы BACE1 и компонентов γ-секретазного комплекса пресенилина 1 и никастрина, участвующих в протеолизе APP в DRG крыс на ранних стадиях после аксотомии.

Материалы и методы. Моделью повреждения периферических нервов были ганглии дорзальных корешков спинного мозга крысы (DRG) после перерезки седалищного нерва. В качестве контроля выступали симметричные ганглии с неаксотомированной контралатеральной стороны того же животного. Иммуноблоттинг использовали для оценки экспрессии и внутриклеточного распределения N- и C-концевых фрагментов APP и секретаз, участвующих в его протеолизе, в клетках DRG крысы после повреждения аксонов. Через 4, 24 часа или 7 дней после перерезки проводили декапитацию и выделение 4-го и 5-го DRG с последующей пробоподготовкой и иммуноблоттингом. Для более подробной картины внутриклеточного распределения APP использовали данные электронной иммуногистохимии.

Результаты. Согласно данным иммуноблоттинга перерезка седалищного нерва способствует накоплению С-концевого фрагмента APP в аксотомированных спинномозговых ганглиях крыс. Через 4 часа после аксотомии уровень C-APP в цитоплазматической фракции ганглиев был низким. Однако через 24 часа и 7 дней после повреждения уровень C-APP значительно увеличился в цитоплазматической фракции аксотомированных ганглиев по сравнению с контрольными ганглиями. Уровень N-APP также был низким в цитоплазматической фракции через 4 часа, но не через 24 часа и 7 дней после перерезки. Через 24 часа и 7 дней после аксонального повреждения нейронов DRG аксотомией седалищного нерва уровень N-APP значительно увеличился по сравнению с контрольными ганглиями. α-секретаза, ADAM10, в основном присутствовала в цитоплазматической фракции клеток DRG. Достаточно высокий уровень белка был отмечен как в контралатеральных ганглиях, так и в аксотомированных DRG через 4 и 24 часа после перерезки. Однако уровень ADAM10 снижался в 2 раза в цитоплазматической фракции поврежденных ганглиев по сравнению с неаксотомированными ганглиями через 7 дней после перерезки аксонов. Таким образом, аксотомия вызвала значительное снижение ADAM10 в цитоплазматической фракции спинномозговых ганглиев на 7-й день после повреждения периферического нерва по сравнению с уровнем белка через 4 и 24 часа. Электронная микроскопия показала, что C- и N-концевые фрагменты APP были связаны с плазматическими мембранами отростков нервных клеток. Наше внимание было привлечено к выраженной кластеризации APP и ADAM10, но не BACE1. Это неожиданно, поскольку BACE1 и пресенилин1 (PS1), каталитическая единица γ-секретазы, локализованы главным образом в устойчивых к детергентам мембранах (DRM) или липидных рафтах, в то время как ADAM10 локализован главным образом в нелипидных рафтовых доменах. Однако в разное время после аксотомии не было обнаружено существенной разницы в экспрессии BACE1 (экспрессия BACE1 в DRG была низкая) и компонентов γ-секретазного комплекса пресенилина 1 и никастрина.

Мы показали, что C- и N-концевые фрагменты APP обнаруживаются только в цитоплазматической фракции, но не в ядерной фракции спинномозговых ганглиев крыс. Аксотомия седалищного нерва вызывает рост как C- так и N-концевых фрагментов APP уже через 24 часа после воздействия. Высокий уровень C- и N-APP сохраняется в цитоплазматической фракции аксотомированных нейронов на 7-й день после перерезки. Аксотомия вызывала значительное снижение ADAM10 в цитоплазматической фракции на 7-й день после перерезки седалищного нерва, влияя на баланс между амилоидогенными и неамилоидогенными путями протеолиза APP.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда № 21-15-00188.

Brain and spinal cord injuries are one of the leading causes of death and disability. The APP protein has been intensively studied since the 1980s due to its central role in the development of Alzheimer’s disease (AD). It is involved in the development, differentiation, and function of neurons, neurite growth, synapse and long-term memory formation, brain integrity maintenance, and neuronal response to damage. However, the specific biochemical and physiological functions of APP and its proteolytic products are still unknown. The accumulation of APP in damaged neurons after peripheral nerve transection indicates its important role in after axotomy -induced pathological processes in the nerve tissue.

Work objective. In this study, we investigated the expression and localization of APP in rat dorsal root ganglia (DRG) of the rat spinal cord after sciatic nerve transaction (SNT). We studied the expression and localization of α-secretase ADAM10, β-secretase BACE1, and components of the γ-secretase complex presenilin 1 and nicastrin involved in APP proteolysis in rat DRG in the early stages after axotomy.

Materials and Methods. The model of peripheral nerve injury was rat dorsal root ganglion (DRG) after SNT. Symmetrical ganglia from the contralateral side of the same animal were used as a control. Immunoblotting was used to estimate the expression and intracellular distribution of N- and C-terminal fragments of APP and secretases involved in APP proteolysis in rat DRG cells after axonal injury. 4, 24 hours or 7 days after the SNT, decapitation and isolation of the 4th and 5th DRGs were performed, followed by sample preparation and immunoblotting. A more detailed picture of the intracellular distribution of the APP is provided by the electron immunohistochemistry data.

Results. According to the immunoblotting data, SNT stimulates the accumulation of the C-terminal APP fragment in the axotomized ganglia. After 4 hours the level of C-APP in the cytoplasmic fraction is low. However, after 24 hours and 7 days, it significantly increased in the cytoplasmic fraction relative to control ganglia. The level of N-APP was also low in the cytoplasmic fraction at 4 hours but not at 24 hours and 7 days after SNT. At 24 hours and 7 days after axonal injury of DRG neurons by sciatic nerve transaction, the level of N-APP in the tissue significantly increased from the control ganglia. α-secretase, ADAM10 is mainly present in the cytoplasmic fraction of the DRG cells. A sufficiently high level of protein is noticed in as well as contralateral ganglia and axotomized DRG at 4 and 24 hours after SNT. However, the level of ADAM10 decreased 2-fold in the cytoplasmic fraction relative to nonaxotomized ganglia 7 days after SNT. Thus, axotomy caused a significant decrease in ADAM10 in the cytoplasmic fraction 7 day after SNT compared to the protein level at 4 and 24 hours after axotomy. Electron microscopy shows that the C- and N-terminal fragments of APP were associated with the plasma membranes of the processes of nerve cells. Our attention was drawn to the pronounced clustering of APP and ADAM10 but not BACE1. This is unexpected since BACE1 and presenilin1 (PS1), the catalytic unit of γ-secretase, are localized mainly in detergent resistant membranes (DRM) or lipid rafts, while ADAM10 is localized mainly in non-lipid raft domains. However, no significant difference was found at different times after SNT for the expression of BACE1 (the expression of BACE1 in DRG relatively low) and components of the γ-secretase complex presenilin 1 and nicastrin.

Here, we showed that C- and N-terminal fragments of APP are found only in cytoplasmic fraction but not in nuclear fraction DRG. SNT caused the growth of both C- and N-terminal regions of APP already after 24 h. A high level of C- and N-APP (that could be predominantly a product of α-secretase (sAPP activity) persisted at cytoplasmic fraction of axotomized neuron the 7th day after SNT. Axotomy caused a significant decrease in ADAM10 in the cytoplasmic fraction 7 day after SNT affecting the balance between amyloidogenic and non-amyloidogenic pathways.

This work was supported by grant no. 21-15-00188 of the Russian Science Foundation.