Посттрансляционному ацетилированию/деацетилированию с помощью гистонацетилтрансфераз (HAT) и деацетилаз гистонов (HDAC) подвергаются не только гистоны, но и негистоновые белки, такие как шапероны, сигнальные белки, факторы транскрипции. Через ацетилирование/деацетилирование регулируется активность негистоновых белков, белок-белковые взаимодействия, их клеточная локализация, что определяет рост, дифференцировку, миграцию и выживание клеток как в норме, так и при патологии.

Травмы периферических нервов (ТПН) – одна из распространенных причин инвалидизации и смертности населения и, как следствие, одна из актуальных проблем здравоохранения не только в России, но и во всем мире. Ситуация ухудшается отсутствием эффективных нейропротекторов, способных защитить нервные клетки, особенно в первые часы после повреждения.

Согласно последним исследованиям фактор транскрипции E2F1 является одним из негистоновых субстратов некоторых HDACs. Известно, что он регулирует экспрессию проапоптотических белков, таких как каспазы 3, 7, 8 и 9, SMAC/DIABLO, Apaf-1, p53, p73, белки семейства Bcl-2 и тем самым стимулирует апоптоз. Однако, исследований, направленных на изучение ацетилирования/деацетилирования негистоновых белков, включая E2F1, в условиях нейродегенерации крайне мало, а исследования этих процессов при травмах периферических нервов практически отсутствуют.

Цель работы. Исследование процессов ацетилирования и деацетилирования фактора транскрипции E2F1 в нейронах и глиальных клетках ПНС млекопитающих в различные периоды после аксотомии периферических нервов.

Материалы и методы. Модель нейротравмы периферических нервов – аксотомированные ганглии корешков спинного мозга крысы (DRG, dorsal root ganglion), полученные путем перерезки седалищного нерва. Опыты с перерезкой седалищного нерва проводились на взрослых крысах-самцах (Wistar, беспородные), весом 200–250 г. Перерезку седалищного нерва и изоляцию DRG осуществляли согласно стандартному протоколу, описанному Savastano et al. Количественную ПЦР проводили с помощью qPCRmix-HS SYBR. Праймеры были синтезированы в ЗАО «Евроген». Методы иммуноблоттинга и двойной иммунофлуоресцентной микроскопии использованы для оценки экспрессии и внутриклеточного распределения ацетилированных форм E2F1 в клетках дорзальных ганглиев крыс. Иммуноблоттинг проводили методом полусухого переноса с помощью системы Trans blot Turbo через 1, 4, 24 часа или 7 дней после аксотомии, объединяя 4 и 5 DRG от трех крыс. Для подтверждения факта межбелкового взаимодействия между HDAC1/ацетилированный E2F1(K120) была проведена ко-иммунопреципитация с помощью набора компании Sileks с использованием магнитных частиц с белком G в соответствие с рекомендациями производителя. В полученном иммунопрецепитате определяли гистондеацетилазную активность HDAC1 в отношении E2F1. Исследование проводили с использованием коммерческого набора твердофазного иммуноферментного анализа для HDAC1. Визуализация белок-белковых взаимодействий была проведена с помощью технологии Duolink® PLA (анализ бесконтактного лигирования). Для изучения механизмов участия исследуемых белков, процессов ацетилирования и деацетилирования в гибели клеток ганглиев, а также возможности нейропротекции после нейротравмы (перерезки седалищного нерва) был использован неселективный ингибитор HDAC I класса вальпроат натрия (i.p. 300 мг/кг). Статистическая обработка производилась с использованием t-критерия Стьюдента и метода ANOVA.

Результаты. В аксотомированных ганглиях дорзальных корешков спинного мозга крысы наиболее ранние и специфичные изменения наблюдаются со стороны гистондеацетилаз HDAC1, экспрессия которой увеличивалась уже через 1 час после перерезки седалищного нерва. Экспрессия фактора транскрипции E2F1 в аксотомированных нейронах ганглиев повышается через 4 часа. Уровень ацетилированного E2F1 (К120) снижаются в цитоплазме нейронов ганглиев через 24 часа после аксотомии. Нейротравма вызывает транслокацию HDAC1, фактора транскрипции E2F1 из ядра в цитоплазму в первые 24 часа после повреждения. Аксотомия седалищного нерва ассоциирована с повышением экспрессии и активности HDAC1 в аксотомированных ганглиях крыс, что приводит к снижению ацетилированного E2F1 (K120) в цитоплазме нейронов. Введение ингибитора HDAC в течение 7 дней после перерезки седалищного нерва снижает уровень E2F1 в цитоплазме, но увеличивает в ядре, что свидетельствует о перераспределении фактора трансрипции между ядром и цитоплазмой, на что также указывает коэффициент колоколизации с ядерным маркером. Таким образом, введение ингибитора HDAC I класса вальпроата натрия отменяет вызванную аксотомией транслокацию E2F1 из ядра в цитоплазму и увеличивает уровень ацетилирования E2F1 по К120 в нейронах ганглиев, защищая их клетки от апоптоза. Это говорит о том, что, во-первых, уровень ацетилирования белка зависит от деацетилазной активности HDAC1, во-вторых, влияет на внутриклеточную локализацию белка.

Суммируя все данные:

1. Изучены белок-белковые взаимодействия фактора транскрипции E2F1 с HDAC1.

2. После выявления пары белков «субстрат-фермент» определена деацетилазная активность HDAC1 в отношении E2F1.

3. Это позволило при помощи ингибитора HDAC I класса перейти к установлению зависимости между ацетилированием регуляторного белка и его активностью в отношении нижестоящих мишеней, а также апоптозом клеток ганглиев после аксонального повреждения.

Полученные данные позволят по-новому взглянуть на функции гистонацетилтрансфераз и деацетилаз гистонов, которые могут быть более обширными, чем регуляция транскрипции. Эти знания лягут в основу теоретической базы, которая может быть далее использована для разработки новых селективных ингибиторов HDAC в качестве потенциальных нейропротекторов, защищающих нейроны и глиальные клетки на ранних сроках после аксонального стресса.

Выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда № 21-15-00188.

Not only histones, but also non-histone proteins such as chaperones, signaling proteins, and transcription factors are subjected to posttranslational acetylation/deacetylation by histone acetyltransferases (HAT) and histone deacetylases (HDAC). The activity of non-histone proteins, protein-protein interactions, and their cellular localization is regulated via acetylation/deacetylation, which determines cell growth, differentiation, migration, and survival both in norm and pathology.

Peripheral nerve injury is one of the common causes of disability and mortality and, as a consequence, one of the current problems of public health not only in Russia, but all over the world. The situation is worsened by the lack of effective neuroprotective agents, especially for the first hours after injury.

According to recent studies, the transcription factor E2F1 is one of the nonhistone substrates of some HDACs. It is known to regulate the expression of pro-apoptotic proteins such as caspases 3, 7, 8, and 9, SMAC/DIABLO, Apaf-1, p53, p73, and Bcl-2 family proteins and thereby promote apoptosis. However, there are very few studies on acetylation/deacetylation of nonhistone proteins, including E2F1, in neurodegeneration, and there are almost no studies on these processes in peripheral nerve injuries.

Work objective. To study the processes of acetylation and deacetylation of the E2F1 transcription factor in mammalian PNS neurons and glial cells in different periods after peripheral nerve axotomy.

Materials and Methods. The model of peripheral nerve injury was axotomized rat dorsal root ganglion (DRG) obtained by sciatic nerve transection. The experiments were performed on adult male rats (Wistar, wild-type), weighing 200-250 g. Sciatic nerve transection and DRG isolation were performed according to the standard protocol described by Savastano et al. Quantitative PCR was performed using qPCRmix-HS SYBR. The primers were synthesized at Eurogen, CJSC. Immunoblotting and double immunofluorescence microscopy were used to estimate the expression and intracellular distribution of acetylated forms of E2F1 in rat dorsal ganglia cells. Immunoblotting was performed by semi-dry transfer using the Trans blot Turbo system 1, 4, 24 hours, or 7 days after axotomy, combining 4th and 5th DRGs from three rats. To confirm the interprotein interaction between HDAC1/acetylated E2F1(K120), co-immunoprecipitation was performed with a kit from the Sileks company using magnetic particles with G protein according to the manufacturer's recommendations. The histone deacetylase activity of HDAC1 towards E2F1 was determined in the obtained immunoprecipitate. The study was performed using a commercial solid-phase enzyme immunoassay kit for HDAC1. Visualization of protein-protein interactions was performed using Duolink® PLA (proximity ligation assay) technique. The nonselective HDAC class I inhibitor sodium valproate (i.p. 300 mg/kg) was used to study the mechanisms of involvement of the studied proteins, acetylation, and deacetylation in ganglion cell death, and the possibility of neuroprotection after the neurotrauma (sciatic nerve transection). Statistical analysis was performed using ANOVA.

Results. In the axotomized DRGs, the earliest and most specific changes were observed in HDAC1 histone deacetylases, whose expression increased as early as in one hour after the sciatic nerve transection. The expression of the E2F1 transcription factor in axotomized ganglion neurons increased in four hours. Acetylated E2F1 (K120) levels decrease in the cytoplasm of ganglion neurons in 24 hours after axotomy. The neurotrauma induces the translocation of HDAC1 and E2F1 from the nucleus to the cytoplasm in the first 24 hours after the injury. Sciatic nerve axotomy is associated with increased expression and activity of HDAC1 in axotomized rat ganglia, resulting in a decrease of acetylated E2F1 (K120) in the neuronal cytoplasm. HDAC inhibitor administration for seven days after sciatic nerve transection decreases the level of E2F1 in the cytoplasm but increases it in the nucleus, indicating a redistribution of the transcription factor between the nucleus and the cytoplasm, which is also indicated by the colocalization coefficient with the nuclear marker. Thus, administration of the HDAC class I inhibitor sodium valproate withdraws the axotomy-induced translocation of E2F1 from the nucleus to the cytoplasm and increases the level of E2F1 acetylation at K120 in ganglion neurons, protecting their cells from apoptosis. This suggests that, firstly, the level of protein acetylation depends on the deacetylase activity of HDAC1, and secondly, it affects the intracellular localization of the protein.

Summarizing all the data:

1. Protein-protein interactions of the E2F1 transcription factor with HDAC1 were studied.

2. After identifying the "substrate-enzyme" protein pair, the deacetylase activity of HDAC1 towards E2F1 was determined.

3. This allowed us to establish the dependence between acetylation of the regulatory protein and its activity towards downstream targets, as well as apoptosis of ganglion cells after axonal damage using a HDAC class I inhibitor.

The obtained data will enable new ways of viewing the functions of histone acetyltransferases and histone deacetylases, which may be more extensive than the transcription regulation. This knowledge will underlie a theoretical framework that can be further used to develop novel selective HDAC inhibitors as potential neuroprotectors that protect neurons and glial cells in the early periods after axonal stress.

This work was supported by grant no. 21-15-00188 of the Russian Science Foundation.