Монооксид азота (NO) является одной из ключевых сигнальных молекул, которые регулируют функции организма, включая нервную систему, как в норме, так и при патологии [1]. Исследования роли NO в жизнедеятельности организмов начались вскоре после обнаружения регуляции NO нормального сосудистого тонуса, как медиатора вазодилатации [2,3,4]. С помощью синтаз уровень NO контролируется в нейронах, нейроглие и микроглие мозга в норме и при патологии путем ферментативных и неферментативных реакций. В естественных условиях функция NO согласуется и координируется с множеством иных регуляторных систем в нервной ткани. Большой интерес привлекает участие NO в механизмах развития различных патологических состояний организма [5]. Обнаружено, что при патологических процессах NO играет как протекторную роль, так и деструктивную, что определяется многими факторами [6]. При развитии патологических процессов в мозге (гипоксия и ишемия) регуляторные системы мозга (включая NO систему) увеличивают активность, что естественным образом сопровождается возрастанием потребления кислорода (что усугубляет гипоксию) и увеличением недоокисленных продуктов в ткани мозга [4,7].

Роль NO системы в этих условиях систематически изучается фактически во всех странах мира, но в этой проблеме фундаментального и прикладного характера есть много неясностей. Одной из причин такой пессимистической ситуации является техническая сложность контроля уровня NO, поскольку NO образуется в процессе быстрых химических реакций с вовлечением широкого спектра молекул и посредников, среди которых металлы, тиолы, свободные радикалы, аминокислоты, кальций, кислород. Поэтому является актуальным изучение биофизических закономерностей изменений содержания NO в мозге при ишемических процессах в головном мозге. Встает вопрос об использовании современного метода обнаружения и количественного определения содержания NO в тканях живых организмов в норме и при экспериментальном моделировании патологий. Одним из наиболее эффективных методов выявления и количественного определения NО в биологических тканях является метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) [8]. Это произошло благодаря методике, разработанной профессором Ваниным и др., которая основана на реакции радикала (в данном случае NO) со спиновой ловушкой. В результате реакции образуется аддукт с характерным спектром ЭПР. Авторы применили комплекс Fe2+ c диэтилдитиокарбаматом (ДЭТК) для захвата NO и формирования устойчивого тройного комплекса (ДЭТК)2-Fe2+-NO в тканях животных. Эти комплексы характеризуются легко распознаваемым спектром ЭПР со значением g-фактора g=2.035 – 2.040 и триплетной сверхтонкой структурой [8, 9]. Метод обладает чувствительностью 0.04–0.4 nM, позволяет проводить прямые измерения, является высокочувствительным за счет применения спиновых ловушек [8]. Авторы предприняли попытку детализировать отдельные биофизические закономерности образования монооксида азота при ишемии головного мозга. Целью данной работы было исследование методом ЭПР спектроскопии с применением методики спиновых ловушек последствий экспериментального ишемического повреждения мозга на интенсивность продукции NO и содержания меди (как показателя супероксиддисмутазы) в гиппокампе крыс.

Результаты показывают достоверное снижение содержания NO в гиппокампе через 1 день после моделирования ишемии, вызванной перевязкой сонных артерий. При проведении моделирования ишемии с одновременным интраназальным введением мезенхемальных стволовых клеток (МСК) не было обнаружено достоверного отличия содержания NO относительно ишемизированных крыс. Через 2 дня содержание NO в гиппокампе ишемизированных крыс восстановилось. В гиппокампе крыс, у которых было проведено моделирование ишемии с одновременным интраназальным введением МСК, через 2 дня не было обнаружено достоверного отличия содержания NO относительно ишемизированных крыс. Содержание меди в гиппокампе крысы через 1 день после моделирования ишемии, вызванной перевязкой сонных артерий, недостоверно снижалось, а через 2 дня наблюдалась тенденция к увеличению. Т.е., как и при измерениях NO прослеживалась тенденция к восстановлению уровня, характерного для интактных животных. Итак, обнаружена тенденция к усилению эффективности работы антиоксидантной системы как через 1, так и через 2 дня после ишемии.

Работа поддержана Белорусским республиканским фондом фундаментальных исследований (грант М23РНФ-067), грантом РНФ № 23-45-10004, Программой стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета (Приоритет – 2030).

1. Steinert et al. Neuroscientist 16 435-452 (2010) https://doi.org/10.1177/1073858410366481

2. Lakomkin et al. Nitric Oxide: Biology and Chemistry 16(4) 413-418 (2007)

3. Андрианов и др. Онтогенез. T. 39, №6. - C. 437-442 (2008)

4. Remizova et al. Eur. J. Pharmacol. 662(1-3) 40-46 (2011)

5. Pacher et al. Physiol. Rev., 2007, v. 87, p. 315-427.

6. Calabrese et al. Antioxidants and Redox Signaling 11, 2717-2739 (2009).

7. Terpolilli et al. J Cereb Blood Flow Metab 32(7): 1332–1346 (2012)

8. Vanin et al. Methods in Enzymology. Vol. 359, pp. 27-42 (2003)

9. Гайнутдинов и др. Биофизика. Т. 58, N 2. С. 276-280 (2013)

Nitric oxide (NO) is one of the key signaling molecules that regulate the body's physiological functions, including the nervous system, both normal and pathological [1]. Studies of the role of NO in the vital activity of organisms began shortly after the discovery of the regulatory role of NO in normal vascular tone as a mediator of vasodilation [2,3,4]. Through synthases, the level of NO is controlled in neurons, neuroglia and microglia of the brain in normal and pathological conditions by enzymatic and non-enzymatic reactions. Under physiological conditions, the function of NO is consistent and in coordination with many other regulatory systems in the nervous tissue. Of great interest is the involvement of NO in the underlying mechanisms of the development of various pathological conditions in the body [5]. It was found that in some pathological processes NO plays both a protective role and a destructive one, which is governed by many factors [6]. The development of pathological processes in the brain (hypoxia and ischemia)is associated with an increase in the activity of the regulatory systems of the brain (including the NO system) This is naturally accompanied by an increase in oxygen consumption (which exacerbates hypoxia) and an increase in under-oxidized products in brain tissue [4,7].

Although, the role of the NO system in these conditions is systematically across the globe, there are still many ambiguities in this fundamental and applied problem. One of the reasons for such a pessimistic situation is the technical complexity of regulating the NO level since NO is formed during rapid chemical reactions involving a wide range of molecules and intermediaries, including metals, thiols, free radicals, amino acids, calcium, and oxygen. It is relevant to study the biophysical patterns of changes in the NO content during ischemic processes in the brain. Therefore, the matter of using modern methods for detecting and quantifying the NO content in the tissues of living organisms in normal and experimental models of pathologies became relevant. One of the most effective methods for identification and quantifying NO in biological tissues is the electron paramagnetic resonance (EPR) method [8]. The authors attempted to detail some biophysical patterns of nitrogen monoxide formation in cerebral ischemia. This method is based on a technique developed by prof. Vanin et al that depends on the reaction of a radical (in this case, NO) with a spin trap. . As a result of the reaction, an adduct with a characteristic EPR spectrum is formed. The authors applied the Fe2+ complex with diethyldithiocarbamate (DETC) to capture NO and form a stable triple complex (DETC)2-Fe2+-NO in animal tissues. These complexes are characterized by an easily recognizable EPR spectrum with a g-factor value of g=2.035 – 2.040 and a triplet hyperfine structure [8,9]. The method has a sensitivity of 0.04–0.4 nM, allows direct measurements, and is highly sensitive due to the use of spin traps [8]. The work aimed o study the effects of experimental ischemic brain damage on the intensity of NO production and copper content (as an indicator of superoxide dismutase) in the hippocampus of rats using EPR spectroscopy with spin trap technique.

The results show a significant decrease in NO content in the hippocampus 1 day after modeling ischemia by carotid artery ligation. When modeling ischemia with simultaneous intranasal administration of mesenchymal stem cells (MSCs), no significant difference in NO content was found between ischemic and control rats. After 2 days, the NO content in the hippocampus of ischemic rats was restored. In the hippocampus of rats in which ischemia was modeled with simultaneous intranasal administration of MSCs, no significant difference in NO content relative to ischemic rats was found after 2 days. The copper content in the rat hippocampus decreased unreliably 1 day after modeling ischemia caused by carotid artery ligation and there was a unreliably tendency to increase 2 days later. All in all, NO measurements indicate a tendency to restore the level of NO characteristic to the intact animals. So was found a tendency to increase the effectiveness of the antioxidant system both 1 and 2 days after ischemia.

Work was supported by the Belarusian Republican Foundation for Basic Research (grant M23RNF-067), grant of RGNF No. 23-45-10004, by Kazan Federal University Strategic Academic Leadership Program (PRIORITY-2030).

1. Steinert et al. Neuroscientist 16 435-452 (2010)

2. Lakomkin et al. Nitric Oxide: Biology and Chemistry 16(4) 413-418 (2007)

3. Andrianov et al. Ontogenesis. V. 39, No. 6. P. 437-442 (2008)

4. Remizova et al. Eur. J. Pharmacol. 662(1-3) 40-46 (2011)

5. Pacher et al. Physiol. Rev., 2007, v. 87, p. 315-427.

6. Calabrese et al. Antioxidants and Redox Signaling 11, 2717-2739 (2009).

7. Terpolilli et al. J Cereb Blood Flow Metab 32(7): 1332–1346 (2012)

8. Vanin et al. Methods in Enzymology. Vol. 359, pp. 27-42 (2003)

9. Gainutdinov et al. Biophysics. Vol. 58, N 2. pp. 276-280 (2013)