Ежегодно регистрируется около 1 млн новых случаев первичного и вторичного рака печени. До сих пор единственным видом терапии остается хирургическое лечение печени. Однако 5-летняя выживаемость после резекции печени достигает 14–61%. Не смотря на современные достижения в хирургической технике и совершенствование методов предоперационной оценки функции печени, сохраняется высокий риск развития послеоперационной печеночной недостаточности, связанный в первую очередь с наличием фоновой печеночной патологии, а также с различием в регенераторном потенциале печени каждого пациента. Стандартные клинические методы оценки состояния ткани печени недостаточно информативны и не позволяют проводить предиктивную оценку регенераторного потенциала оставшейся печени. Таким образом, актуальной задачей остается поиск новых методов и критериев для интраоперационной экспресс оценки структуры и функции печени, которые бы позволили выявить наличие патологических изменений уже на ранних стадиях, а также оценить регенераторный потенциал ремнанта печени. Современные label-free методы мультифотонной микроскопии с режимами время-разрешенной микроскопии (FLIM) и генерации второй оптической гармоники (ГВГ) расширяют возможности изучения структурно-функционального состояния ткани печени на клеточном уровне.

Серии экспериментов проводились на крысах линии Wistar. Индукция нормальной регенерации проводилась путем 30% и 70% гепатэктомии (ГЭ). Индукция фиброза проводилась путем введения CCl4 в течение 8 недель. Индукция стеатоза проводилась путем 60% высокожировой диеты в течение 12 недель. На разных этапах патологии проводилась индукция регенерации путем 70% ГЭ. Мониторинг изменений в регенерирующей печени проводили на 3 и 7 день после ГЭ. Анализ структуры ткани печени проводили методом мультифотонной микроскопии. Оценка содержания коллагена в ткани проводилась методом ГВГ. С применением FLIM определяли вклады времен жизни флуоресценции связанных форм НАДН (а2,%) и НАДФН (а3,%). В качестве контроля проводили морфологический и морфометрический анализ и стандартный биохимический анализ крови.

Показано, что печень в норме и при нормальной регенерации характеризуется равномерным распределением сигнала автофлуоресценции НАД(Ф)Н и отсутствием накопления коллагена в ткани. Методом FLIM было выявлен основной оптический критерий успешной регенерации - резкое увеличение вкладов а2 и а3 на 3 день регенерации, что связано с усилением интенсивности окислительного фосфорилирования и биосинтетических процессов в гепатоцитах.

При индукции стеатоза и фиброза выявляются зоны со сниженным сигналом автофлуоресценции НАД(Ф)Н, ассоциированные с очагами фиброзирования и липидной инфильтрации. Методом FLIM показано снижение вкладов а2 и а3 на ранних стадиях патологии, с последующим увеличением данных параметров на поздних этапах. При индукции регенерации на поздних стадиях патологии было показано отсутствие скачка а2 и а3 на 3 день регенерации, что связано с развитием липотоксичности и митохондриальной дисфункции в гепатоцитах.

Таким образом, были выявлены оптические критерии успешной регенерации печени – это равномерное распределение сигнала автофлуоресценции НАД(Ф)Н, а также резкое увеличение вкладов связанной формы НАДН и НАДФН. Критериями снижения регенераторного потенциала печени при наличии патологии является появление зон со сниженным сигналом автофлуоресценции НАД(Ф)Н, а также отсутствие резкого скачка вкладов связанной формы НАДН и НАДФН на поздних этапах развития патологии. Полученные результаты послужат основой для разработки критериев для проведения предиктивной экспресс-оценки состояния ткани печени в клинике.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 19-15-00263 (метаболический имиджинг, анализ FLIM данных) и гранта РНФ № 22-25-00098 (морфологический анализ образцов печени).

More than 1 million new cases of primary and secondary liver cancer are registered annually. The only type of therapy remains surgical treatment of the liver. However, 5-year survival after liver resection reaches 14-61%. Despite modern advances in surgical technique and the improvement of methods for preoperative assessment of liver function, there is still a high risk of postoperative liver failure, associated with the presence of background hepatic pathology, as well as with the difference in the regenerative potential of the liver of each patient. Standard clinical methods for assessing the state of the liver tissue are not sufficiently informative and do not allow a predictive assessment of the regenerative potential of the liver remnant. Thus, the search for new methods and criteria for intraoperative rapid assessment of the structure and function of the liver remains an urgent task, which would make it possible to detect the presence of pathological changes already in the early stages, as well as to assess the regenerative potential of the liver remnant. Modern label-free methods of multiphoton microscopy with time-resolved microscopy (FLIM) and optical second harmonic generation (SHG) expand the possibilities of studying the structural and functional state of liver tissue at the cellular level.

A series of experiments were carried out on Wistar rats. Normal regeneration was induced by 30% and 70% partial hepatectomy (PH). Fibrosis was induced by administration of CCl4 for 8 weeks. Steatosis was induced with a 60% high fat diet for 12 weeks. At different stages of the pathology, we induced regeneration by 70% PH. Monitoring of the regenerating liver was carried out on days 3rd and 7th after PH. Using multiphoton microscopy, we performed analysis of the liver tissue structure. The assessment of collagen content in the tissue was carried out by the SHG. Using FLIM, we analyzed the contributions of the fluorescence lifetimes of bound forms of NADH (a2,%) and NADPH (a3,%). Morphological and morphometric analysis and a standard biochemical blood test were performed as control methods.

As a result, we revealed that the regeneration of normal liver is characterized by a uniform distribution of the NAD(P)H autofluorescence signal and the absence of collagen accumulation in the tissue. The FLIM method revealed the main optical criterion for successful regeneration - a sharp increase in the contributions of a2 and a3 on the 3rd day of regeneration, which is associated with an increase in the intensity of oxidative phosphorylation and biosynthetic processes in hepatocytes.

In case of induced steatosis and fibrosis, we identified zones with a reduced NAD(P)H autofluorescence signal associated with foci of fibrosis and lipid infiltration. Using FLIM we showed a decrease in the contributions of a2 and a3 in the early stages of pathology, with a subsequent increase in these parameters in the later stages. With the induction of regeneration at the later stages of the pathology, there is no jump in a2 and a3 on the 3rd day of regeneration, which is associated with lipotoxicity and mitochondrial dysfunction in hepatocytes.

Thus, we identified the optical criteria for successful liver regeneration: a uniform distribution of the NAD(P)H autofluorescence signal, as well as a sharp increase in the contributions of the fluorescence lifetimes of the bound form of NADH and NADPH. The criteria for violated liver regenerative potential in the presence of pathology defined by zones with a reduced NAD(P)H autofluorescence signal, as well as the absence of a sharp jump in the contributions of the bound form of NADH and NADPH at the later stages of pathology. The results obtained could be useful for the developing criteria for a predictive express-assessment of the state of the liver tissue in the clinic.

The work was supported by the Grant from the Russian Science Foundation №19-15-00263 (metabolic imaging, analysis of FLIM data), and by the Grant from the Russian Science Foundation №22-25-00098 (morphological analysis).