В 1980-е годы было установлено, что активированные макрофаги (МФ), культивируемые совместно с опухолевыми клетками-мишенями, убивают клетки-мишени. И агентом, ответственным за гибель опухолевых клеток, является синтезируемый макрофагами оксид азота. Было показано, что ингибирование синтеза NO в макрофагах проводит к снижению противоопухолевой сопротивляемости организма и установление этого основного факта внесло огромный вклад в расширение исследований, связанных с образованием и функцией NO в норме и при патологии. И хотя имеются разнообразные, иногда и противоречивые данные о роли NO в развитии опухолей, всё же определённо установлено, что NO, синтезированный лейкоцитами и макрофагами, играет основную роль в их способности уничтожать опухолевые клетки.

Оказалось, что поддерживаемая продолжительная продукция NO в макрофагах обеспечивает их цитостатическую/цитотоксическую активность не только по отношению к опухолевым клеткам, но и в отношении вирусов, бактерий, грибков, простейших, гельминтов. На клеточных линиях и линиях мышей было показано, что резистентность к микробам часто связана с экспрессией индуцируемой NO-синтазы (iNOS). Более прямое доказательство роли iNOS было получено вначале Hibbs J. и его коллегами (1987 г.), а затем и многими другими исследователями. Они использовали ингибиторы iNOS и показали, что ингибиторы ухудшают течение болезней, вызванных множеством вирусов и бактерий. Очевидно, что NO не единственный антипатогенный эффектор иммунной защиты, но в значительном большинстве случаев он является либо индуктором, либо исполнителем бактерицидной программы. Поэтому повышение синтеза (NO) в клетках иммунной системы имеет важное значение для повышения устойчивости организма к инфекционным заболеваниям, и, возможно, исходя из данных литературы, и профилактике опухолевых заболеваний.

В работе использовали перитонеальные макрофаги, выделенные стандартным способом вымывания содержимого брюшной полости мышей линии SHK 0,9% раствором NaCl . Собранные клетки дважды промывали тем же раствором и центрифугировали при 250 g в течение 10 мин. Осадок суспендировали в физрастворе. Концентрация клеток составила 2х109 в 1 мл. Для питания клеток добавляли 2% р-р сывротки КРС (Biowest, France). Оказалось, что выделенные стандартным способом перитонеальные МФ, инкубируемые при комнатной температуре, без дополнительного стимулирования также могут синтезировать незначительное количество NO. которое можно было обнаружить по появлению нитритов и нитратов, являющихся стабильными продуктами окисления NO и регистрируемых методом УФ-спектроскопии при поглощении 330-340 нм. При исследовании обрзования NO методом ЭПР в качестве ловушки NO использовали Hb, который имеет высокое сродство к NO, и при взаимодействии с ним образует стабильные нитрозильные комплексы Гем- NO (НК Гем-NO), которые обусловливают хорошо известный сигнал ЭПР – широкий синглет с g-фктором 2,02 и характерным триплетным расщеплением 17 Гс при g-факторе 2,01. Суспензии МФ были инкубированы в течение 20 и 48 ч как в присутствии АК, так и без неё. К 48 ч интенсивность сигнала ЭПР НК Гем-NO а, следовательно, и количество образовавшегося NO, в образцах, инкубированных с АК более, чем втрое превышали интенсивность этого сигнала в образцах без АК. Количественная оценка показала, что каждая клетка МФ в условиях эксперимента за 48 часов могла синтезировать до 1,5х109 молекул NO. По спектрам поглощения нитритов/нитратов было зафиксировано меньшее увеличение синтеза NO, чем методом ЭПР. Это связано с тем, что в опытах ЭПР все образующиеся молекулы NO акцептируются гемоглобином, приводя к появлению стабильных НК Гем- NO, тогда как при регистрации спектров поглощения до тех пор, пока не израсходована вся АК в надосадочной жидкости, образовавшиеся нитриты частично могут разлагаться под действием АК. По полученным и имеющимся в литературе данным, можно сделать наиболее вероятное предположение, что основная роль АК заключается в восстановлении кофакторов iNOS. NO-синтаза - тщательно регулируемый фермент и для нормального функционирования этого фермента необходимы 6 кофакторов: FMN, FAD, NADH, BH4, NADPH и связанный с активным центром кальмодулин. При этом, ключевым кофактором iNOS является тетрагидробиоптерин (ВН4), который окисляется при работе iNOS, превращаясь в дигидробиоптерин (BH2 ). АК восстанавливает BH2 и тем самым поддерживает уровень ВН4, восстанавливая активность iNOS, что в результате приводит к увеличению синтеза NO.

In the 1980s, it was found that activated macrophages (MP), cultured together with target tumor cells, kill target cells. And the agent responsible for the death of tumor cells is nitric oxide (NO) synthesized by macrophages. The participation of NO in the cytotoxic activity of macrophages to tumor cells was one of the first functional properties described for this molecule. It was shown that inhibition of NO synthesis in macrophages leads to a decrease in the antitumor resistance of the body, and the discovery of this basic fact made a great contribution to the increased number of studies devoted to the formation and function of NO in normal and pathological conditions. Although there are various, sometimes contradictory data on the role of NO in the development of tumors, it has definitely been established that NO synthesized by leukocytes and macrophages plays a main role in their ability to destroy tumor cells. It was shown that sustained continuous production of NO in macrophages ensures their cytotoxic/ cytostatic activity not only to tumor cells, but also to viruses, bacteria, fungi, protozoa, and helminths.

On cell lines and mouse, lines were found that resistance to microbes is often associated with the expression of the induced NO synthase (iNOS). More direct evidence of the iNOS role was obtained first by Hibbs J. and his colleagues (1987), and then by many other researchers. They used iNOS inhibitors and showed that inhibitors worsen the course of diseases caused by many viruses and bacteria. The mechanisms of nitric oxide action were established. They included inhibition of mitochondrial respiration (MR) and DNA synthesis, iron loss by cells, and inhibition of enzymes involved in the Krebs cycle. NO is obviously not the only anti-pathogenic immune defense effector, but in most cases, it is either an inducer or an executor of a bactericidal program. Therefore, the increased (NO) synthesis in the cells of the immune system is important in raising the body's resistance to infectious diseases, and, possibly, due to the available literary data, the prevention of tumor diseases.

Peritoneal macrophages were isolated by the standard method of washing the contents of the abdominal cavity of SHK mice with a 0.9% NaCl solution. The collected cells were washed twice with the same solution and centrifuged at 250 g for 10 min. The precipitate was suspended in saline. The cell concentration was 2x109 in 1 ml. To feed the cells, 2% serum solution of cattle was added (Biowest, France).

But it turned out that peritoneal MP isolated in a standard way, incubated at room temperature, can also synthesize a small amount of NO without additional stimulation, which could be detected by the presence of nitrites and nitrates, which are stable products of NO oxidation and are registered by UV spectroscopy upon absorption of 330-340 nm. This MP ability was used in this work to study the effect of AA on NO synthesis in these cells. UV and ESR spectroscopy methods were used for recording NO formed in MP suspension incubated at room temperature with and without AA. When studying the formation of NO by ESR, Hb was used as an NO trap, which has a high affinity to NO, and interacting with it, forms stable nitrosyl Hem-NO complexes (Heme-NO NCs), which determine the well-known ESR signal - a wide singlet with g-factor 2.02 and characteristic triplet splitting of 17 G with a g-factor of 2.01.

Suspension of peritoneal macrophages (MP) specimens of mice incubated with AA (10 mM) and without it within 48 hours. By 48 h, the intensity of the ESR signal of Heme-NO NC and, consequently, the amount of NO formed in the samples incubated with AA was more than three times higher than the intensity of this signal in samples without AA. A quantitative assessment showed that in these conditions, 1.5 x 109 NO molecules are produced in macrophages per cell by 48 hours under the action of AA.

UV absorption in samples incubated with AA was significantly higher (more than twice) than in supernatant samples of macrophages incubated without AA. It should be noted that the amount of nitrite formed in the samples in which the absorption spectrum is actually should really be more than registered, since AA has not yet been used completely, part of the formed nitrite decomposes again under the action of AA. Therefore, in experiments using the ESR method, when the all formed NO molecules are accepted by hemoglobin, by 48 hours, there was a more than 3-fold increase in NO amount compared to control samples.

To answer the question on the mechanisms of AA action further studies are necessary. However, according to the data obtained and those available in literature, it is possible to suggest that the main role of AA is to restore iNOS cofactors. NO-synthase is a carefully regulated enzyme and for its normal functioning 6 cofactors are necessary: FMN, FAD, NADH, BH4, NADPH and calmodulin connected with the active center. Moreover, tetrahydrobiopterin (BH4), which is considered a necessary participant in the synthesis of NO as a redox active cofactor, is a key cofactor of iNOS. AA is necessary to prevent the irreversible oxidation of the key cofactor of the NO-synthase of tetrahydrobiopterin BH4 to dihydrobiopterin BH2 and thereby maintain the iNOS activity and increases NO synthesis.