Монтмориллонит (ММ) – это пористый природный глинистый материал, относящийся к подклассу смектитов и состоящий из гидроксида кремния с ионами магния, алюминия и др., с высокой сорбционной способностью, обусловливающей его эффективность в качестве энтеросорбента и перспективного средства доставки лекарств, в том числе, и благодаря биосовместимости, превышающей показатели для других наноматериалов [1]. В кишечнике он может способствовать развитию микроорганизмов-пробиотиков и проявлять защитные свойства в отношении слизистой оболочки [2].

При воспалительных заболеваниях кишечника местные эффекты ММ могут зависеть от взаимодействия между минеральными частицами и нейтрофилами, инфильтрующими стенку кишечника. Известно, что ММ вызывает быстрый лизис нейтрофилов в отсутствие белков сыворотки крови, предположительно, вследствие электростатических взаимодействий между поверхностью частиц и фосфолипидами клеточной мембраны, сопровождающихся активацией дыхательного взрыва нейтрофилов [3]. Адсорбированные на частицах белки сыворотки предотвращают лизис нейтрофилов и их активацию, однако эффекты муцина, основного компонента слизистых оболочек, не были изучены. Ранее мы показали, что муцин способен оказывать провоспалительное действие на нейтрофилы в случае его адсорбции минеральными частицами ватерита [4] и фосфата кальция [5]. Нашей целью было изучение эффектов муцина при активации нейтрофилов микрочастицами ММ in vitro.

Методы исследования. Оценка адсорбции муцина по убыли его концентрации в растворе после инкубации с ММ и ее визуализация с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ); анализ активации дыхательного взрыва изолированных нейтрофилов крови человека по образованию супероксидного радикала, детектируемого методом люцигенин-зависимой хемилюминесценции (люц-ХЛ); определение цитотоксичности ММ методом прямого подсчета клеток в камере Горяева; оценка поверхностного заряда с помощью дзета-сайзера.

Результаты. Микрочастицы ММ, дзета-потенциал которых составлял -30±3 мВ, стимулировали выброс супероксидного радикала нейтрофилами, одновременно вызывая лизис 50-70% клеток; при этом величина люц-ХЛ ответа была пропорциональна концентрации целых клеток в пробах. Была показана быстрая сорбция 90% добавленного в пробу люцигенина (52 ± 7 нмоль/мг ММ) без непосредственного влияния на величину люц-ХЛ. Обработка ММ раствором муцина приводила к связыванию гликопротеина, которое варьировало в диапазоне 2 – 17 мкг/мг ММ. По данным СЭМ, выявлялись частицы, не связавшие муцин; с мозаичными участками связывания; полностью покрытые муцином. Связывание муцина с ММ не влияло на последующую адсорбцию люцигенина, и только при максимальном связывании муцина было выявлено снижение лизиса клеток в пробах при измерении ХЛ (на 23 ± 13%). При этом величина люц-ХЛ была пропорциональна концентрации целых клеток, как и в случае частиц ММ, необработанных муцином, то есть специфическое усиление активации нейтрофилов за счет адсорбированного муцина отсутствовало, в отличие от эффектов муцина, сорбированного на микрочастицах карбоната и фосфата кальция [4, 5]. Зависимость эффектов сорбированного муцина от природы минеральных частиц связана, по-видимому, с различиями в механизмах взаимодействия частиц с мембраной нейтрофила.

Выводы. Муцин, связываясь с частицами ММ, частично предотвращает лизис нейтрофилов, не вызывая при этом усиления продукции ими супероксидного радикала. Отсутствие провоспалительного действия сорбированного на ММ муцина является важным условием безопасного перорального применения этих минеральных частиц.

Работа поддержана Российским научным фондом (грант № 23-45-10026).

Литература

1. Gaharwar A.K., Mihaila S.M., Swami A., Patel A., Sant S., Reis R.L., Marques A.P., Gomes M.E., Khademhosseini A. Bioactive silicate nanoplatelets for osteogenic diffrentiation of human human mesenchymal stem cells. Adv. Mater. 2013, 2524, 3329–3336.

2. Park J.H., Shin H.J., Kim M.H., Kim J.S., Kang N., Lee J.Y., Kim K.T., Lee J.I., Kim D.D. Application of montmorillonite in bentonite as a pharmaceutical excipient in drug delivery systems. J. Pharm. Investig. 2016, 46, 363-375.

3. Dougherty S.H., Fiegel V.D., Nelson R.D., Rodeheaver G.T., Simmons R.L. Effects of soil infection potentiating factors on neutrophils in vitro. Am. J. Surg. 1985, 150, 306-311.

4. Mikhalchik E., Basyreva L.Y., Gusev S.A., Panasenko O.M., Klinov D.V., Barinov N.A., Morozova O.V., Moscalets A.P., Maltseva L.N., Filatova L.Y., Pronkin E.A., Bespyatykh J.A., Balabushevich N.G. Activation of neutrophils by mucin-vaterite microparticles. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 10579.

5. Mikhalchik E.V., Boychenko O.P., Moskalets A.P., Morozova O.V., Klinov D.V., Basyreva L.Yu., Gusev S.A., Panasenko O.M., Filatova L.Yu., Balabushevich N.G. Stimulation of neutrophil oxidative burst by calcium phosphate particles with sorbed mucin. Rus. Open Med. J. 2021, 10, CID e0428.

Montmorillonite (MM) is a porous natural aluminomagnesium silicate clay of a subclass of smectite with high adsorption capacity which contributes to its efficacy as enterosorbent and promising component for drug delivery systems, also due to its biocompatibility exceeding that of other nanomaterials [1]. In the intestine it can function as probiotic-protecting agent with potential protective effect for mucosa [2].

In conditions of intestinal inflammation, the local effects of MM could depend on interaction between mineral particles and neutrophils infiltrating gastrointestinal wall. Earlier it was shown that MM induces fast lysis of neutrophils in absence of proteins of blood serum, presumably, via electrostatic interactions between particles surface and phospholipids of cell membrane accompanied by activation of neutrophil respiratory burst [3]. Serum proteins adsorbed onto the particles prevent neutrophil lysis and activation but there is no data on effects of mucin, the major component of mucosa. Earlier we have shown that mucin acquired proinflammatory properties towards neutrophils when adsorbed onto microparticles of calcium carbonate [4] or phosphate [5]. Our aim was to study effects of mucin on activation of neutrophils by MM microparticles in vitro.

Methods: evaluation of mucin adsorption by decrease of its concentration in solution after incubation with MM and its visualization using scanning electron microscopy (SEM); analysis of activation of respiratory burst of neutrophils isolated from normal human blood as superoxide radical generation measured by lucigenin chemiluminescence (Luc-CL); analysis of cytotoxicity of MM by direct cell count using Goryaev chamber; evaluation of surface charge using zeta-sizer.

Results. MM microparticles with surface charge of -30±3 mV stimulated generation of superoxide radical by neutrophils with lysis of 50-70% cells; Luc-CL value correlated with concentration of undestroyed cells in the probes. Fast sorption of 90% of lucigenin added into the probes (52 ± 7 nmole/mg ММ) was registered, with no direct impact on CL values. Incubation of MM in mucin solution resulted in binding of glycoprotein which varied from 2 to 17 µg/mg MM. According to SEM images, there were particles not coated with mucin or with partial mucin coating or totally coated with mucin. Binding of mucin to MM did not influence subsequent sorption of lucigenin by the particles, and only at maximal adsorption of mucin the partial decrease in cell lysis (by 23 ± 13%) was detected in the probes after CL measurement. Like with untreated MM particles, Luc-CL was proportional to whole cells number, so no specific enhancement of neutrophil activation was induced by adsorbed onto MM mucin, unlike our results obtained earlier with mucin-coated calcium carbonate or phosphate microparticles [4, 5]. Dependence of effects of adsorbed mucin on the nature of mineral particles obviously originates from different mechanisms of their interaction with neutrophil membrane.

Conclusion. Mucin coating of MM partially prevents neutrophil lysis, with no enhancement of generation of superoxide radical by the cells. The absence of proinflammatory effects of mucin adsorbed onto MM microparticles is important for safe peroral application of these particles.

The study is financially supported by Russian scientific foundation (grant no. 23-45-10026).

References

1. Gaharwar A.K., Mihaila S.M., Swami A., Patel A., Sant S., Reis R.L., Marques A.P., Gomes M.E., Khademhosseini A. Bioactive silicate nanoplatelets for osteogenic diffrentiation of human human mesenchymal stem cells. Adv. Mater. 2013, 2524, 3329–3336.

2. Park J.H., Shin H.J., Kim M.H., Kim J.S., Kang N., Lee J.Y., Kim K.T., Lee J.I., Kim D.D. Application of montmorillonite in bentonite as a pharmaceutical excipient in drug delivery systems. J. Pharm. Investig. 2016, 46, 363-375.

3. Dougherty S.H., Fiegel V.D., Nelson R.D., Rodeheaver G.T., Simmons R.L. Effects of soil infection potentiating factors on neutrophils in vitro. Am. J. Surg. 1985, 150, 306-311.

4. Mikhalchik E., Basyreva L.Y., Gusev S.A., Panasenko O.M., Klinov D.V., Barinov N.A., Morozova O.V., Moscalets A.P., Maltseva L.N., Filatova L.Y., Pronkin E.A., Bespyatykh J.A., Balabushevich N.G. Activation of neutrophils by mucin-vaterite microparticles. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 10579.

5. Mikhalchik E.V., Boychenko O.P., Moskalets A.P., Morozova O.V., Klinov D.V., Basyreva L.Yu., Gusev S.A., Panasenko O.M., Filatova L.Yu., Balabushevich N.G. Stimulation of neutrophil oxidative burst by calcium phosphate particles with sorbed mucin. Rus. Open Med. J. 2021, 10, CID e0428.