Ввиду растущей угрозы радиоактивного загрязнения среды по причине возможных аварий на объектах радиационной промышленности, увеличивающегося количества радиоактивных отходов и вероятности применения и испытаний ядерного оружия, разработка эффективных и безопасных радиозащитных препаратов остаётся весьма актуальной задачей. Эти препараты необходимы и для облегчения последствий лучевой терапии у онкологических больных, а также профилактики лучевого поражения у космонавтов. И несмотря на то, что данной проблемой занимаются с середины прошлого века, считать её решённой на настоящий момент не представляется возможным.

Это связано со слабым радиозащитным действием используемых радиопротекторов с низкой химической токсичностью и высокой токсичностью хорошо действующих радиопротекторов: индралина и амифостина, применяемых, соответственно, в России и на Западе [1].

Однако в литературе имеются сообщения, что препараты на основе хлорофилла могут обладать значительными радиозащитными свойствами (подробнее – см. обзор [2]). За рубежом большое внимание уделяли хлорофиллину – водорастворимому производному хлорофилла [3–5]. Имеются сведения о его защитном действии на генетический аппарат облучённых животных [3, 4] и о возможном подавлении им метаболизма липидных радиотоксинов [5]. Способность хлорофиллина подавлять перекисное окисление липидов была доказана при использовании метода регистрации хемилюминесценции [6].

В России концепцию об использовании препаратов на основе хлорофилла как радиозащитных средств, независимо от иностранных коллег, предложил профессор Н.П. Лысенко. Он делал упор на применении непосредственно самого хлорофилла. В выполненной под его руководством докторской диссертации [7] было показано увеличение под его действием выживаемости мышей, подвергшихся воздействию γ-излучения, и снижение содержания в их печени и сыворотки крови продуктов липидной пероксидации.

Для успешного применения препаратов на основе хлорофилла необходимо определить наиболее эффективную клинически приемлемую форму препарата. Перспективным видится применение водорастворимого хлорофиллина. Поэтому именно он был выбран для дальнейших исследований.

В эксперименте, проведённом совместно с мл. научн. сотр. лаб. Радиационной биофизики ФМБЦ им. А.И. Бурназяна М.А. Игнатовым, суспензия лимфоцитов человека, предварительно инкубированная в присутствии Na-Cu-хлорофиллина в концентрациях 5–100 мкМ, подвергалась воздействию рентгеновского излучения в дозе 2 Гр. Проведённая после этого методом щелочного гель-электрофореза единичных клеток оценка степени повреждения ДНК не выявила достоверных отличий между образцами, инкубированными в хлорофиллине различных концентраций, и контрольными пробами.

Этот результат стал причиной проведения исследования на предмет способности Na-Cu-хлорофиллина проникать внутрь лимфоцитов. В ходе него суспензия лимфоцитов инкубировалась в растворе хлорофиллина концентрацией 300 мкМ, после чего лимфоциты с помощью центрифугирования при 200 g в течение 20 минут были отделены от среды инкубации и были лизированны 0,5% тритоном X-100. Спектрофотометрическая оценка содержания хлорофиллина в лизатах и среде инкубации выявила, что концентрация хлорофиллина в лизатах лимфоцитов оказалась выше, чем в среде. Это позволило предположить, что он проникает в цитоплазму по механизму активного транспорта.

Однако через ядерную мембрану хлорофиллин, скорее всего, не проникает. Этим можно объяснить то, что он не смягчил деструктивное действие рентгеновского излучения на ДНК лимфоцитов в облучённой суспензии, а в работах [3, 4], в которых оценивалось его действие в клетках костного мозга и сперматогониях облучённых мышей, хлорофиллин показал генопротекторный эффект. Данные клетки постоянно претерпевают митоз, в ходе которого ядерная мембрана разрушается. Поэтому хлорофиллин из цитоплазмы легко оказывался в их ядрах, где уже мог защитить их генетический аппарат.

А так как наибольшей радиочувствительностью обычно обладают именно быстроделящиеся клетки, хлорофиллин можно считать веществом, достойным дальнейшего изучения на предмет использования для нивелирования последний лучевого поражения.

Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда № 23-24-00383, https://rscf.ru/project/23-24-00383/.

Литература

1. Рождественский Л.М. Проблемы разработки отечественных противолучевых средств в кризисный период: поиск актуальных направлений развития // Радиационная биология. Радиоэкология. 2020. № 60(3) – С.: 279–290. doi: 10.31857/S086980312003011X

2. Ромодин Л.А., Лысенко Н.П. Радиопротекторное действие препаратов на основе хлорофилла // Биофизика. 2022. № 67(1) – С.: 96–104. doi: 10.31857/S0006302922010094

3. Morales-Ramirez P., Mendiola-Cruz M.T. In vivo radioprotective effect of chlorophyllin on sister chromatid exchange induction in murine spermatogonial cells // Mutation research. 1995. № 344(1-2) – P.: 73–78. doi: 10.1016/0165-1218(95)90041-1

4. Morales-Ramirez P., Garcia-Rodriguez M.C. In vivo effect of chlorophyllin on gamma-ray-induced sister chromatid exchange in murine bone marrow cells // Mutation research. 1994. № 320(4) – P.: 329–334. doi: 10.1016/0165-1218(94)90085-x

5. Kumar S.S., Shankar B., Sainis K.B. Effect of chlorophyllin against oxidative stress in splenic lymphocytes in vitro and in vivo // Biochimica et biophysica acta. 2004. № 1672(2) – P.: 100–111. doi: 10.1016/j.bbagen.2004.03.002

6. Ромодин Л.А. Угнетение хлорофиллином хемилюминесценции, сопровождающей катализируемую комплексом цитохрома c с кардиолипином квазилипоксигеназную реакцию // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. 2020. № 20(4) – С.: 427–432. doi: 10.18500/1816-9775-2020-20-4-427-432

7. Поздеев А.В. Разработка радиозащитных средств на основе веществ растительного и минерального происхождения. Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук. 2015. Кострома – 313 с.

Due to the growing threat of radioactive contamination of the environment caused by potential accidents at radiation industry facilities, the increasing amount of radioactive waste, and the likelihood of using or testing nuclear weapons, the development of effective and safe radioprotective drugs remains a very critical task. These drugs are also needed to alleviate the effects of radiation therapy in cancer patients, as well as to prevent radiation injuries in astronauts. Even though people have been working on this problem since the mid-20th century, it cannot be considered resolved at present.

This is due to the poor radioprotective effect of the used radioprotective agents with low chemical toxicity and the high toxicity of more effective radioprotective agents used in Russia and in the West, respectively: indralin and amifostine [1].

However, it is reported in the literature that chlorophyll-based drugs can have significant radioprotective properties (see the review [2] for more details). In other countries, a lot of attention has been focused on chlorophyllin, a water-soluble chlorophyll derivative [3–5]. There is information about its protective effect on the genetic apparatus of animals exposed to radiation [3, 4] and its potential ability to suppress the metabolism of lipid radiotoxins [5]. The ability of chlorophyllin to suppress lipid peroxidation was proven using the method of recording of chemiluminescence [6].

In Russia, the concept of using chlorophyll-based drugs as radioprotective agents was suggested by Professor N.P. Lysenko independently of his foreign colleagues. He focused on the use of chlorophyll itself. A doctoral dissertation [7] written under his supervision showed that the use of this substance resulted in an increase in the survival of mice exposed to γ-radiation and a decrease in the content of lipid peroxidation products in their liver and blood serum.

To be able to use chlorophyll-based drugs successfully, we need to determine the most effective clinically acceptable form of the drug. The use of water-soluble chlorophyllin seems promising. Therefore, it was chosen for further research.

In an experiment conducted in cooperation with M.A. Ignatov, a junior research fellow of the Radiation Biophysics Laboratory of the A.I. Burnazyan Federal Medical Biophysical Center, a suspension of human lymphocytes pre-incubated in the presence of 5 μM to 100 μM of Na-Cu-chlorophyllin was exposed to an X-ray radiation dose of 2 Gy. Then the degree of DNA damage was evaluated using alkaline single-cell gel electrophoresis which showed no significant differences between the samples incubated with different concentrations of chlorophyllin and control samples.

This finding was the reason for conducting a study on the ability of Na-Cu-chlorophyllin to penetrate lymphocytes. During the study, a suspension of lymphocytes was incubated in a chlorophyllin solution with a concentration of 300 μM, after which the lymphocytes were separated from the incubation medium by centrifugation at 200 g for 20 minutes and were lysed with 0.5 % Triton X-100. Spectrophotometric determination of chlorophyllin content in the lysates and the incubation medium showed a higher chlorophyllin concentration in lymphocyte lysates compared to the medium. This suggests that it penetrates the cytoplasm by an active transport mechanism.

However, it is unlikely that chlorophyllin penetrates the nuclear membrane. This can explain the fact that it did not mitigate the destructive effect of X-ray radiation on the lymphocyte DNA in the radiation-exposed suspension, and the studies [3, 4] that evaluated its effect in bone marrow cells and spermatogonia of radiation-exposed mice showed a gene-protective effect of chlorophyllin. These cells constantly undergo mitosis which destroys the nuclear membrane. Therefore, chlorophyllin from the cytoplasm easily found its way to their nuclei, where it was able to protect their genetic apparatus.

Since it is the rapidly dividing cells that are usually the most radiosensitive, chlorophyllin can be considered a substance worthy of further investigation as a means to prevent radiation injury.

The study was funded by grant No. 23-24-00383 of the Russian Science Foundation, https://rscf.ru/project/23-24-00383/.

References

1. Rozhdestvensky L.M. Challenges in the Design of Russian Radiation Protection Means in the Crisis Period: The Search for Key Directions of Development // Biology Bulletin. 2020. № 47(12) – P.: 1659–1668. doi: 10.1134/S1062359020120080

2. Romodin L.A., Lysenko N.P. The radioprotective effect of chlorophyll-based drugs // Biophysics. 2022. № 67(1) – P.: 78–84. doi: 10.1134/S0006350922010158

3. Morales-Ramirez P., Mendiola-Cruz M.T. In vivo radioprotective effect of chlorophyllin on sister chromatid exchange induction in murine spermatogonial cells // Mutation research. 1995. № 344(1-2) – P.: 73–78. doi: 10.1016/0165-1218(95)90041-1

4. Morales-Ramirez P., Garcia-Rodriguez M.C. In vivo effect of chlorophyllin on gamma-ray-induced sister chromatid exchange in murine bone marrow cells // Mutation research. 1994. № 320(4) – P.: 329–334. doi: 10.1016/0165-1218(94)90085-x

5. Kumar S.S., Shankar B., Sainis K.B. Effect of chlorophyllin against oxidative stress in splenic lymphocytes in vitro and in vivo // Biochimica et biophysica acta. 2004. № 1672(2) – P.: 100–111. doi: 10.1016/j.bbagen.2004.03.002

6. Romodin L.A. Chlorophyllin inhibits chemiluminescence that accompanies a quasi-hypoxygenase reaction catalyzed by the cytochrome C-cardiolipin complex // Izvestiya of Saratov University. Chemistry. Biology. Ecology. 2020. № 20(4) – P.: 427–432. doi: 10.18500/1816-9775-2020-20-4-427-432

7. Pozdeev A.V. Development of radioprotective agents based on substances of plant and mineral origin. Dissertation for the degree of Doctor of Biological Sciences. 2015. Kostroma – 313 p.