Глиомы - первичные опухоли центральной нервной системы, являются наиболее распространенным злокачественным новообразованием головного мозга у взрослых. Порядка 70 % первичных опухолей головного мозга представлены различными глиомами, из них более половины на момент постановки диагноза имеют высокую степень злокачественности. Лечение глиом включает микрохирургическое удаление опухоли, при этом объем резекции опухоли достоверно коррелирует с продолжительностью жизни пациентов. В связи с агрессивным ростом глиом с диффузной инвазией в здоровую ткань головного мозга, возникают сложности в определении границ резекции опухолевой ткани. Актуальной задачей в данной области является разработка новых высокочувствительных методов быстрой интраоперационной диагностики. В качестве перспективной технологии рассматривается FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging) собственной (или авто-) флуоресценции тканей (Lukina et al. Frontiers in Oncol. 2019; Yuzhakova et al. Frontiers in Oncol. 2022).

Целью работы являлось ex vivo исследование автофлуоресценции глиальных опухолей и нормальных тканей мозга пациентов методом FLIM-микроскопии.

Нативные образцы глиальных опухолей пациентов исследовали с помощью FLIM-микроскопии в спектральном канале метаболического кофактора НАД(Ф)Н. Было исследовано 12 образов глиом различной степени злокачественности: Grade II (диффузная астроцитома) n=5, Grade III (анапластическая астроцитома) n=3 и Grade IV (глиобластома) n=4, а также образцы белого вещества, перитуморальной области, и коры головного мозга. Образцы транспортировали в лабораторию в 10% БСА (бычий сывороточный альбумин) на льду, в течение 30 мин после хирургического удаления опухоли. Анализ автофлуоресценции методом FLIM проводили на лазерном сканирующем микроскопе LSM 880 (Carl Zeiss, Германия), оснащенном FLIM модулем, основанном на время-коррелированном счете единичных фотонов TCSPC (Becker&Hickl GmbH, Германия). Возбуждение автофлуоресценции осуществлялось в двухфотонном режиме на длине волны 750 нм фемтосекундным лазером Mai Tai HP (Spectra-Physics, США). Флуоресценцию детектировали в диапазоне 450-490 нм. Мощность лазерного возбуждения на образце составляла 6 мВт. Время сбора сигнала составляло 120 с. В экспериментах использовался масляно-иммерсионный объектив С-Apochromat W Korr с х40/1.2. Параметры затухания флуоресценции оценивали в программе SPCImage (среднее время жизни τm, время жизни короткой τ1 и длинной τ2 компонент, относительные вклады короткой a1 и длинной a2 компонент).

Методом FLIM-микроскопии показано, что глиальные опухоли разной степени злокачественности имеют отличия во времени жизни автофлуоресценции. Продемонстрировано, что глиобластомы (Grade IV) статистически значимо отличаются от астроцитом (Grade II и Grade III) по среднему времени жизни флуоресценции НАД(Ф)Н: τm (Grade IV) = 1,02(0,88;1,14), τm (Grade II) = 1,05(0,93;1,14) (р=0,042), τm (Grade III) = 1,04(0,95;1,11) (р=0,00075); по относительному вкладу короткой компоненты: a1 (Grade IV) = 71,42(68,78;73,83), a1 (Grade II) = 69,62(66,59;73,76) (р=9,5*10-6), a1 (Grade III) = 70,40(67,95;73,02) (р=0,0096). Зарегистрированные значения параметров затухания флуоресценции в образцах опухолей (τm ~1 нс, τ1 ~0,4, τ2~2,5, a1~72%) соответствовали типичным значениям метаболического кофактора НАД(Ф)Н. Поэтому на основании полученных данных можно сделать предположения о сдвиге метаболического статуса глиобластом в сторону гликолиза, что ведет к повышению вклада свободного НАД(Ф)Н. Образцы белого вещества головного мозга и перитуморальные области характеризовались большим вкладом длинной компоненты: 69,08±3,72 % и 68,74±3,46 %, соответственно, по сравнению с образцами астроцитом и глиобластом.

Таким образом, метод FLIM позволяет различать между собой глиальные опухоли разной степени злокачественности и отличать опухолевую ткань от нормальной (белое вещество головного мозга) и от перитуморальных областей по параметрам затухания автофлуоресценции НАД(Ф)Н.

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ, проект № 22-25-01198.

Gliomas are primary tumors of the central nervous system and are the most common malignant neoplasm of the brain in adults. About 70% of primary brain tumors are represented by various gliomas, of which more than half have a high degree of malignancy at the time of diagnosis. The treatment of gliomas includes microsurgical removal of the tumor, while the volume of tumor resection significantly correlates with the life expectancy of patients. Due to the aggressive growth of gliomas with diffuse invasion into healthy brain tissue, it is difficult to determine the boundaries of tumor tissue resection. An urgent task in this area is the development of new highly sensitive methods for rapid intraoperative diagnostics. FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging) of intrinsic (or auto-) fluorescence of tissues is considered as a promising technology (Lukina et al. Frontiers in Oncol. 2019; Yuzhakova et al. Frontiers in Oncol. 2022).

The aim of this work was to study the autofluorescence of glial tumors and normal brain tissues ex vivo using FLIM microscopy.

Native samples of glial tumors of patients were studied using FLIM microscopy in the spectral channel of the metabolic cofactor NAD(P)H. Twelve samples of gliomas of various grades of malignancy were explored: Grade II (diffuse astrocytoma) n=5, Grade III (anaplastic astrocytoma) n=3 and Grade IV (glioblastoma) n=5, as well as samples of white matter, peritumoral area, and cerebral cortex. Samples were transported to the laboratory in 10% BSA (bovine serum albumin) on ice, within 30 min after surgical removal of the tumor. Autofluorescence analysis by FLIM was performed on a laser scanning microscope LSM 880 (Carl Zeiss, Germany) equipped with a FLIM module based on time-correlated single photon counting TCSPC (Becker&Hickl GmbH, Germany). Autofluorescence was excited in the two-photon mode at a wavelength of 750 nm by a Mai Tai HP femtosecond laser (Spectra-Physics, USA). Fluorescence was detected in the range of 450-490 nm. The laser excitation power on the sample was 6 mW. The signal acquisition time was 120 s. An oil-immersion C-Apochromat W Korr lens with x40/1.2 was used in the experiments. The fluorescence decay parameters were estimated using the SPCImage program (average lifetime τm, lifetimes of the short τ1 and long τ2 components, and the relative contributions of the short a1 and long a2 components).

FLIM microscopy showed that glial tumors of different grades of malignancy have differences in autofluorescence lifetime. It has been demonstrated that glioblastomas (Grade IV) differ statistically significantly from astrocytomas (Grade II and Grade III) in terms of the mean lifetime of NAD(P)H fluorescence: τm (Grade IV) = 1.02(0.88;1.14), τm (Grade II) = 1.05(0.93;1.14) (p=0.042), τm (Grade III) = 1.04(0.95;1.11) (p=0.00075); by the relative contribution of the short component: a1 (Grade IV) = 71.42(68.78;73.83), a1 (Grade II) = 69.62(66.59;73.76) (р=9.5* 10-6), a1 (Grade III) = 70.40(67.95; 73.02) (p=0.0096). The recorded values of fluorescence decay parameters in tumor samples (τm ~1 ns, τ1 ~0.4, τ2~2.5, a1~72%) corresponded to typical values of the metabolic cofactor NAD(P)H. Therefore, based on the data obtained, it can be assumed that the metabolic status of glioblastomas shifts towards glycolysis, which leads to an increase in the contribution of free NAD(P)H. Samples of the white matter of the brain and peritumoral areas were characterized by a large contribution of the long component: 69.08±3.72% and 68.74±3.46%, respectively, compared with samples of astrocytomas and glioblastomas.

Thus, the FLIM method makes it possible to distinguish between glial tumors of different grades of malignancy and to distinguish tumor tissue from normal (white matter of the brain) and from peritumoral areas by the parameters of NAD(P)H autofluorescence decay.

This work was supported by the Russian Science Foundation, project № 22-25-01198.