Введение. Центральной проблемой в лечении глиомы является низкая эффективность стандартных схем химиотерапии, не учитывающих индивидуальных особенностей опухоли пациента. Развивающимся направлением в решении данной проблемы является разработка персонализированного подхода на основе использования пациент-специфических моделей и оценки эффективности терапии с помощью перспективного метода флуоресцентной время-разрешенной микроскопии (FLIM) метаболических коферментов. FLIM основан на детектировании времени жизни флуоресценции молекул, и отличается от стандартных методов оценки тем, что не требует использования красителей, деструкции клеток и тканей, позволяет получать данные в режиме реального времени.

Цель работы. Разработка новой технологии оценки метаболического ответа глиом на химиотерапию с использованием время-разрешенной флуоресцентной микроскопии.

Материалы и методы. Исследования проводили на культурах клеток, полученных из послеоперационного материала пациентов с диагнозом астроцитома высокой степени злокачественности (Grade II-IV). Краткосрочные культуры выделяли путем механической дезагрегации и культивирования мелких фрагментов опухоли. Химиотерапию проводили препаратом Темодал (OrionPharma, Финляндия). Визуализацию автофлуоресценции метаболического кофермента никотинамиддинуклеотида (фосфата) НАД(Ф)Н осуществляли с помощью конфокального микроскопа LSM 880 (Carl Zeiss, Германия) с FLIM приставкой на основе время-коррелированного счета одиночных фотонов TCSPC (Becker & Hickl, Германия) (возбуждение 375 нм, прием 435 – 485 нм).

Результаты. Была набрана библиотека первичных культур глиом пациентов. Была разработана технология оценки метаболического ответа культур глиом после воздействия химиотерапией. Технология включает в себя оптимизированные условия выделения и культивирования краткосрочных культур, подобранные дозы химиопрепарата для воздействия на культуры и параметры визуализации НАД(Ф)Н методом FLIM.

Показано, что использование метода FLIM позволяет выявлять культуры глиом с метаболическим ответом, развивающимся в результате действия химиотерапии. Было продемонстрировано увеличение относительного вклада связанной c белком формы НАД(Ф)Н a2% в среднее время жизни флуоресценции в опухолевых клетках после инкубации с Темодалом в течение 72 ч, что коррелирует со снижением жизнеспособности после проведения химиотерапии по результатам МТТ-теста. Наличие подобных изменений может быть связано с метаболическим сдвигом в сторону окислительного фосфорилирования и снижением пролиферативной активности опухолевых клеток в результате эффективно подобранной схемы терапии. В том случае, если не наблюдается изменений в параметрах времени жизни НАД(Ф)Н, либо регистрируется снижение относительного вклада a2, это коррелирует с отсутствием выраженного ответа клеток на химиотерапию.

Выводы. Инновационный метод FLIM-имиджинга способен выявлять метаболические изменения в культурах глиом пациентов после химиотерапии на основе параметров времени жизни флуоресценции НАД(Ф)Н. Разработанная технология оценки метаболического ответа опухолевых клеток на лечение может являться эффективным подходом для подбора персонализированной терапии. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ (проект № 21-75-00098).

Introduction. The central problem in the treatment of glioma is the low effectiveness of standard chemotherapy regimens that do not take into account the individual characteristics of the patient's tumor. A developing direction in solving this problem is the development of a personalized approach based on the use of patient-specific models and evaluation of the effectiveness of therapy using a promising method of fluorescence time-resolved microscopy (FLIM) of metabolic coenzymes. FLIM is based on the detection of fluorescence lifetime of molecules, and differs from standard assessment methods in that it does not require the use of dyes, destruction of cells and tissues, and allows you to obtain data in real time.

The purpose of the work. Development of a new technology for assessing the metabolic response of gliomas to chemotherapy using time-resolved fluorescence microscopy.

Materials and methods. The studies were provided on cell cultures obtained from postoperative material of patients diagnosed with high-grade astrocytoma (Grade II-IV). Short-term cultures were isolated by mechanical disaggregation and cultivation of small tumor fragments. Chemotherapy was performed with Temodal (Orion Pharma, Finland). Visualization of autofluorescence of the metabolic coenzyme nicotinamide dinucleotide (phosphate) NAD(P)H was carried out using a confocal microscope LSM 880 (Carl Zeiss, Germany) with a FLIM application based on a time-correlated count of single photons TCSPC (Becker & Hickl, Germany) (excitation 375 nm, registration 435 – 485 nm).

Results. A library of primary cultures of patients' gliomas was recruited. A technology was developed to assess the metabolic response of glioma cultures after exposure to chemotherapy. The technology includes optimized conditions for isolation and cultivation of short-term cultures, selected doses of a chemotherapy drug for exposure to cultures and parameters of NAD(P)H visualization using the FLIM method.

It has been shown that the use of the FLIM method makes it possible to identify glioma cultures with a metabolic response developing as a result of the action of chemotherapy. An increase in the relative amplitude of the protein-bound NAD(P)H form a2% was demonstrated in the average lifetime of fluorescence in tumor cells after incubation with Temodal for 72 hours, which correlates with a decrease in viability after chemotherapy according to the results of the MTT test. The presence of such changes may be associated with a metabolic shift towards oxidative phosphorylation and a decrease in the proliferative activity of tumor cells as a result of an effectively selected therapy regimen. In the event that there are no changes in the parameters of the lifetime NAD(P)H, or a decrease in the relative amplitude a2 is recorded, this correlates with the absence of a cell response to chemotherapy.

Conclusions. The innovative FLIM imaging method is able to detect metabolic changes in glioma cultures of patients after chemotherapy based on the parameters of the fluorescence lifetime of NAD(P)H. The developed technology for assessing the metabolic response of tumor cells to treatment can serve as an effective approach for the selection of personalized therapy. The work was carried out with the financial support of the Russian Science Foundation grant (project No. 21-75-00098).