Рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных новообразований [1]. Измененная иммунореактивность больных раком предстательной железы становится причиной появления аутоантител к антигенам ассоциированных с опухолью (ААО), определение которых имеет решающее значение в диагностике и прогнозе заболевания. Эффективный поиск индивидуального профиля наиболее иммуногенных ААО позволяет реализовать современная технология SERPA (Serological Proteome Analysis) [2], включающая сочетание методов 2D электрофореза, иммуноблотинга и масс-спектрометрии (секвенирование пептидов).

Цель исследования. Использование технологии SERPA в определении имуннореактивных мишеней в опухолевой ткани пациентов с аденокарциномой предстательной железы (АПЖ), как дополнительный метод диагностической стратегии.

Материал и методы. Исследование проводилось в лаборатории клеточных технологий центра репродуктивной и клеточной медицины ГБУЗ «ДГКБ г. Краснодар», было обследовано 10 пациентов: из них у троих была подтверждена высокодифференцированная ацинарная АПЖ, у остальных – очаги хронического воспаления с признаками доброкачественной гиперплазии. Материалом исследования служили образцы тканей простаты, полученных в ходе тонкоигольной биопсии, а также аутосыворотка пациентов. Промытые биоптаты гомогенизировали в регидратационном буфере (7М мочевина, 2М тиомочевина, 4% CHAP, 30mM Tris/HCl pH 9.0, апротинин) с последующим центрифугированием клеточного лизата при 14000×g (30 минут при 4оС). Белки супернатанта осаждали ацетоном (при – 20°С) с дальнейшей вакуумной сушкой осадка и растворением в регидратационном буфере (ReadyPrep™ 2D Rehydration/Sample Duffer, Bio-Rad). Для каждого образца готовили два идентичных 2D геля, один из которых использовали для переноса на ПВДФ мембрану (Trans-Blot® Turbo LF PVDF, Bio-Rad) и выявления иммуногенных мишеней, а другой – для их вырезания и масс-спектрометрической идентификации. После пассивной регидратации двух IPG-стрипов (IPG-стрипы ReadyStrip pH 3-10, 11 см., Bio-Rad), на каждый из которых наносили 185 мкл образца, проводили изофокусирование (PROTEAN® i12™ IEF System, Bio-Rad) с последующим электрофорезом стрипов в полиакриламидных гелях (AnykD™ Criterion™ TGX Stain-Free™ Protein Gel 11 cm IPG, Bio-Rad). 2D гели окрашивали (Bio-Safe™ Coomassie Stain, Bio-Rad) и один из них использовали для переноса (Trans-Blot® TurboTM, Bio-Rad) на мембрану, которую подвергали иммуноблотингу, где в качестве первичных антител применяли аутосыворотку пациента (1:200), а местоположения иммунореактивных мишеней определяли колориметрической детекцией (Goat Anti-Humane IgG (H + L)-HRP Conjugate). Целевые пятна-мишени на мембране тщательно сопоставляли с соответствующими пятнами на втором окрашенном 2D геле, после чего их вырезали из геля, проводили трипсинолиз (Bruker Daltonics, Германия) с последующей идентификацией на MALDI-TOF масс-спектрометре Аutoflex Speed (Bruker), в рефлекторном режиме и диапазоне масс 800-4000 Да. Наиболее выраженные пики TOF-спектра подвергали MALDI-TOF-MS/MS анализу (сиквенирование). Поиск проводили с использованием программного обеспечения Biotools v3.2 (Bruker) в базе данных измерений MS и MS/MS и обращением к поисковой системе MASCOT (Matrix Science Ltd) при пороговом скоре более 56 баллов (р<0,05) по шкале MOWSE для SwissProt.

Результаты и обсуждение. Технология SERPA позволила установить высокую аутоиммунореактивность против белковых мишеней АПЖ, среди которых выделялись изменения активности α-енолазы (ENO1), альдолазы (ALDO), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), концентрации аннексина А2 (ANXA2). Возможным объяснением аутоиммунного ответа против выраженной активности гликолитических ферментов (ENO1, ALDO, GAPDH) является высокая экспрессия в опухолевых клетках, связанная с кардинальной перестройкой энергетического метаболизма в пользу "аэробного" гликолиза (эффект Варбурга) [3] для нужд интенсивной пролиферации и роста. Помимо этого, ENO1, GAPDH и ANXA2 участвуют в рецептор-опосредованной конверсии плазминогена в плазмин [4], который обеспечивает ремоделирование межклеточного матрикса и создание оптимальных условий для активной миграции и метастазирования клеток опухоли. У пациентов с признаками хронического воспаления и гиперплазии иммунореактивность по отношению к данным маркерам была незначительной. Таким образом, применение технологии SERPA позволяет проводить эффективный поиск индивидуального профиля наиболее иммуногенных ААО.

Выводы. Технология SERPA позволяет специфически идентифицировать иммунореактивные мишени клеток АПЖ, что открывает дополнительные возможности для новых диагностических и терапевтических стратегий.

1. Сомов А. Н., Суслин С. А. Рак предстательной железы. Эпидемиология, факторы риска и раннее выявление //Profilakticheskaya Meditsina. – 2020. – Т. 23. – №. 3.

2. Deutsch E. W. et al. Advances and utility of the human plasma proteome //Journal of proteome research. – 2021. – Т. 20. – №. 12. – С. 5241-5263.

3. Zhivotovsky B. The Warburg Effect returns to the cancer stage //Semin Cancer Biol. – 2009. – Т. 19. – С. 1-3.

4. Ceruti P. et al. Three are better than one: plasminogen receptors as cancer theranostic targets //Experimental hematology & oncology. – 2013. – Т. 2. – №. 1. – С. 1-11.

Prostate cancer is one of the most common neoplasms [1]. Altered immunoreactivity of patients with prostate cancer causes the appearance of autoantibodies to tumor-associated antigens (AAO), the determination of which is crucial in the diagnosis and prognosis of the disease. An effective search for an individual profile of the most immunogenic AAO allows the implementation of modern SERPA (Serological Proteome Analysis) technology [2], which includes a combination of 2D electrophoresis, immunoblotting and mass spectrometry (peptide sequencing) methods.

The purpose of the study. The use of SERPA technology in the determination of immunoreactive targets in the tumor tissue of patients with prostate adenocarcinoma (APJ), as an additional method of diagnostic strategy.

Material and methods. The study was conducted in the laboratory of cellular technologies of the Center for Reproductive and Cellular Medicine of the State Medical Institution "DGKB Krasnodar", 10 patients were examined: three of them had highly differentiated acinar APJ, the rest had foci of chronic inflammation with signs of benign hyperplasia. The study material was prostate tissue samples obtained during a fine needle biopsy, as well as autoserum of patients. The washed biopsies were homogenized in a rehydration buffer (7M urea, 2M thiourea, 4% CHAP, 30mM Tris/HCl pH 9.0, aprotinin) followed by centrifugation of cell lysate at 14000×g (30 minutes at 4oC). The supernatant proteins were precipitated with acetone (at -20°C) with further vacuum drying of the precipitate and dissolution in a rehydration buffer (ReadyPrep ™ 2D Rehydration/Sample Duffer, Bio–Rad). Two identical 2D gels were prepared for each sample, one of which was used for transfer to a PVDF membrane (Trans-Blot ® Turbo LF PVDF, Bio-Rad) and detection of immunogenic targets, and the other for their excision and mass spectrometric identification. After passive rehydration of two IPG strips (IPG strips ReadyStrip pH 3-10. 11 cm, Bio-Rad), on each of which 185 µl of the sample was applied, isofocusing (PROTEAN ® i12 ™ IEF System, Bio-Rad) was performed, followed by electrophoresis of the strips in polyacrylamide gels (AnykD ™ Criterion ™ TGX Stain-Free Protein Gel 11 cm IPG, Bio-Rad). 2D gels were stained (Bio-Safe ™ Coomassie Stain, Bio-Rad) and one of them was used for transfer (Trans-Blot ® TurboTM, Bio-Rad) to a membrane that was subjected to immunoblotting, where the patient's autoserum was used as primary antibodies (1:200), and the locations of immunoreactive targets were determined by colorimetric detection (Goat Anti-Humane IgG (H + L)-HRP Conjugate). The target spots on the membrane were carefully compared with the corresponding spots on the second colored 2D gel, after which they were cut out of the gel, trypsinolysis was performed (Bruker Daltonics, Germany), followed by identification on the MALDI-TOF Autoflex Speed mass spectrometer (Bruker), in reflex mode and in the mass range 800-4000 Da. The most pronounced peaks of the TOF spectrum were subjected to MALDI-TOF-MS/MS analysis (sequencing). The search was performed using Biotools v3.2 (Bruker) software in the MS and MS/MS measurement database and by accessing the MASCOT search engine (Matrix Science Ltd) with a threshold score of more than 56 points (p<0.05) on the MOWSE scale for SwissProt.

Results and discussion. SERPA technology made it possible to establish high autoimmunoreactivity against protein targets of APJ, among which there were changes in the activity of α-enolase (ENO1), aldolase (ALDO), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), and the concentration of annexin A2 (ANXA2). A possible explanation for the autoimmune response against the pronounced activity of glycolytic enzymes (ENO1, ALDO, GAPDH) is the high expression in tumor cells associated with a radical restructuring of energy metabolism in favor of "aerobic" glycolysis (Warburg effect) [3] for the needs of intensive proliferation and growth. In addition, ENO1, GAPDH and ANXA2 are involved in the receptor-mediated conversion of plasminogen to plasmin [4], which ensures the remodeling of the intercellular matrix and the creation of optimal conditions for active migration and metastasis of tumor cells. In patients with signs of chronic inflammation and hyperplasia, immunoreactivity with respect to these markers was insignificant. Thus, the use of SERPA technology allows for an effective search for an individual profile of the most immunogenic AAO.

Conclusions. SERPA technology makes it possible to specifically identify immunoreactive targets of APJ cells, which opens up additional opportunities for new diagnostic and therapeutic strategies.

1. Somov A. N., Suslin S. A. Prostate cancer. Epidemiology, risk factors and early detection //Profilakticheskaya Meditsina. – 2020. – Vol. 23. – No. 3.

2. Deutsch E. W. et al. Advances and utility of the human plasma proteome //Journal of proteome research. – 2021. – Vol. 20. – no. 12. – pp. 5241-5263.

3. Zhivotovsky B. The Warburg Effect returns to the cancer stage //Semin Cancer Biol. – 2009. – Vol. 19. – pp. 1-3.

4. Ceruti P. et al. Three are better than one: plasminogen receptors as cancer theranostic targets //Experimental hematology & oncology. - 2013. – Vol. 2. – No. 1. – pp. 1-11.