Основной проблемой в области иммунотерапии глиомы являются недостаточные знания об индивидуальных особенностях иммунных механизмов для каждого конкретного пациента. Для успешного применения иммунотерапевтических подходов, таких как чек-поинт ингибиторы и CAR-терапия, в отношении глиальных опухолей требуется внедрение персонализированного подхода.

Исследования проводили с использованием материала от пациентов с диагнозом астроцитома Grade II-IV, прооперированных в Университетской клинике ПИМУ.

Разработана новая пациент-специфическая 3D модель глиомы с иммунным микроокружением. Для этой цели создана библиотека первичных глиальных и лимфоцитарных культур пациентов, а также разработан оригинальный подход, включающий оптимизированные методики экстракции клеток, технологию культивирования трехмерной опухолевой структуры на основе культивируемого фрагмента ткани либо сфероида, условия наращивания и схему сокультивирования клеток. Для анализа субпопуляционного состава и активационного профиля лимфоцитов использовали клеточный сортер BD FACSAria III. Для моделирования микроокружения, близкого к реальному, анализировали дополнительно субпопуляционный состав опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов.

Установлено, что иммунные клетки в присутствии опухолевых антигенов сохраняют жизнеспособность и активно пролиферируют.

Продемонстрировано, что данная модель способна отражать ответ иммунных и опухолевых клеток на различные виды чек-поинт иммунотерапии. Как пример, добавление анти-CTLA4 терапевтического антитела к 3D модели конкретного пациента приводит к значительному увеличению числа иммунных клеток и снижению числа опухолевых по сравнению с контролем без лечения, а также к увеличению уровня экспрессии CD25 в пуле CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток по сравнению с контролем без лечения. Однако добавление анти-PD-1 антитела к модели данного пациента не привело к терапевтическому эффекту.

Второй блок экспериментов посвящен клеточной иммунотерапии с использованием новых модифицированных/таргетированных линейных NK клеток. Показана высокая цитотоксическая активность “усиленных” YT клеток с оверэкспрессией белка VAV1 и нокаутом гена CISH, а также линии с CAR-рецептором, специфичным к EGFRvIII. Помимо стандартных методов, ответ клеток на терапию оценивали с помощью метаболического имиджинга FLIM в канале кофермента НАД(Ф)Н (ex. 375 нм, em. 435 – 485 нм) на конфокальном микроскопе LSM 880 (Carl Zeiss, Германия) с FLIM приставкой TCSPC (Becker & Hickl, Германия). Установлено значимое возрастание среднего времени жизни флуоресценции НАД(Ф)Н в глиальных клетках сфероидов при инкубировании с модифицированными иммунными клетками, что может быть ассоциировано со сдвигом метаболизма в сторону окислительного фосфорилирования и, соответственно, со снижением пролиферации глиальных клеток.

Работа поддержана Грантом Президента № МК-2092.2022.3 (3D модель глиобластомы с лимфоцитарным микроокружением, чек-поинт иммунотерапия) и РНФ №22-64-00057 (клеточная терапия).

The main problem in the field of glioma immunotherapy is insufficient knowledge about the individual characteristics of immune mechanisms for each individual patient. Successful application of immunotherapeutic approaches, such as check-point inhibitors and CAR therapy, to glial tumors requires the implementation of a personalized approach.

The studies were carried out using material from patients with glioma Grade II-IV, operated at the PIMU University Hospital.

A new patient-specific 3D model of glioma with an immune microenvironment has been developed. For this purpose, a library of primary glial and lymphocyte cultures of patients has been created, and an original approach has been developed, including optimized methods of cell extraction, a technology for cultivating a three-dimensional tumor structure (based on a spheroid or a cultured tissue fragment), growth conditions, and a cell co-cultivation scheme. The BD FACSAria III cell sorter was used to analyze the subpopulation and activation profile of lymphocytes. To simulate a microenvironment close to the real one, we additionally analyzed the subpopulation composition of tumor-infiltrating lymphocytes.

It has been established that immune cells in the presence of tumor antigens remain viable and actively proliferate.

It has been demonstrated that this model is able to reflect the response of immune and tumor cells to various types of check-point immunotherapy. As an example, the addition of an anti-CTLA4 therapeutic antibody to a 3D model of a particular patient results in a significant increase in the number of immune cells and a decrease in the number of tumor cells compared to an untreated control, as well as an increase in the expression level of CD25 in the pool of CD4+ T cells and CD8+ T cells compared to control without treatment. However, the addition of an anti-PD-1 antibody to this patient model did not result in any therapeutic effect.

The second block of experiments is devoted to cellular immunotherapy using new modified/targeted linear NK cells. A high cytotoxic activity of “enhanced” YT cells with overexpressed VAV1 protein, which enhances cytotoxic activity, and knockout of the CISH gene, which modulates susceptibility to IL-15, as well as a line with a CAR receptor specific for EGFRvIII, was demonstrated on the model of glioblastoma spheroids. In addition to standard methods, the response of cells to therapy was assessed using advanced optical metabolic imaging FLIM in the NAD(P)H coenzyme channel (ex. 375 nm, em. 435 – 485 nm) on a confocal microscope LSM 880 (Carl Zeiss, Germany) with FLIM prefix TCSPC (Becker & Hickl, Germany). It was shown that cell therapy with these lines led to a statistically significant increase in the mean lifetime of NAD(P)H fluorescence in tumor cells, which may be associated with a shift in metabolism towards oxidative phosphorylation and, accordingly, with a decrease in glial cell proliferation.

The work was supported by Grant of the President # MK-2092.2022.3 (3D model of glioblastoma with immune microenvironment, check-point therapy) and Russian Science Foundation # 22-64-00057 (cell therapy).