Возбудитель туберкулеза (ТБ) - Mycobacterium tuberculosis обладает способностью в неблагоприятных условиях образовывать покоящиеся формы, которые не только приобретают устойчивость ко всем известным антибактериальным препаратам, но способны десятилетиями сохранять жизнеспособность в организме человека и переходить в активное состояние и вызывать возобновление болезни. Распространение штаммов микобактерий с широкой и множественной лекарственной устойчивостью, диктует необходимость разработки новых подходов к борьбе с этими заболеваниями. Одним из возможных подходов является метод фотодинамической инактивации (ФДИ), неспецифичность повреждающего воздействия которого препятствует появлению резистентности. В значительной мере применение этого метода ограничивается неглубоким проникновением используемого на практике света для возбуждения порфиринов, хлоринов, метиленовой сини. Длина волны необходимого для их активации излучения ограничивается 690 нм, что соответствует видимому диапазону. Эксперименты с применением фотосенсибилизаторов, активируемых ближним инфракрасным диапазоном (740 нм), в отношении микобактерий ранее не проводились.

Целью данной работы являлось разработка новой стратегии борьбы с микобактериями путем метода ФДИ с применением фотосенсибилизаторов (ФС) на основе трикарбоцианиновых красителей, способных вызывать фотодинамический эффект с использованием света с более глубоким проникновением в ткани животных и человека.

В качестве объекта исследования был использован непатогенный и быстрорастущий близкий генетический родственник возбудителя туберкулеза - Mycolicibacterium (basonym: Mycobacterium) smegmatis. В качестве основы фотосенсибилизаторов применяли гидрофильную (ПК220) и гидрофобную (ПК154) формы индотрикарбоцианиновых красителей. Максимум полосы поглощения фотосенсибилизаторов расположен на 742 нм и полуширина составляет 70 нм, максимум спектра флуоресценции расположен на 758 нм, полуширина 41 нм.

Суточную культуру клеток M. smegmatis, для которой оптическая плотность составляла OD590 >1, разбавляли средой NB до оптической плотности OD590 = 0,2 и инкубировали с красителями в течение 2 ч при температуре 37°С в темноте при постоянном перемешивании. Облучение производилось излучением светодиода 740 нм (SOLIS-740C, Thorlabs, США) при плотности мощности 260 мВт/см2. Экспозиционная доза для образцов составляла 78, 234, 468 Дж/см2, что соответствовало времени облучения 5, 15 и 30 минут. Оценка жизнеспособности бактерий проводили путем высева на агаризованную среду NB методом разведений.

В результате выявлено, что при концентрации 40 μM красителя ПК220 и световой дозе 468 Дж/см2 наблюдается значительная гибель клеток M. smegmatis (89%). При световой дозе 78 Дж/см2 погибало 50 % бактериальных клеток. Использование гидрофобной формы этого фотосенсибилизатора демонстрировало более выраженный фотодинамический эффект. При концентрации 40 μM красителя ПК154 и световой дозе 468 Дж/см2 количество погибших клеток M. smegmatis составило 97 %, вероятно вследствие лучшего связывания ФС с гидрофобной стенкой микобактерий.

Таким образом, проведенное исследование впервые демонстрирует возможность in vitro фотоинактивации микобактерий на примере быстрорастущего родственника возбудителя туберкулеза – M. smegmatis с использованием фотосенсибилизаторов, активируемых излучением в ближнем инфракрасном диапазоне. Данное направление является перспективным для разработки методов борьбы с туберкулезом наряду с антибиотикотерапией.

Работа поддержана грантом РНФ № 19-15-00324.

The causative agent of tuberculosis (TB) - Mycobacterium tuberculosis has the ability to form dormant forms under unfavorable conditions, which not only acquire resistance to all known antibacterial drugs, but also has the ability to maintain viability in the human body for decades and cause the resumption of the disease. The spread of mycobacterium strains with multidrug resistance dictates the need to develop new approaches to combat these diseases. One of those opportunities is the method of photodynamic inactivation (PDI), the non-specificity of the damaging effect of which prevents the development of resistance. To a large extent, the application of this method is limited by the shallow penetration of light used for excitement of porphyrins, chlorins, methylene blue. The wavelength of the radiation required for their activation is limited to 690 nm, which corresponds to the visible range. Experiments with the use of photosensitizers activated by the near infrared range (740 nm) have not been carried out against mycobacteria before.

The aim of this work was to develop a new strategy for combating mycobacteria by the PDI ofmethod using photosensitizers (PS) based on tricarbocyanin dyes which are capable to cause a photodynamic effect using light with longer wavelength that result to deeper penetration into animal and human tissues.

A non-pathogenic and fast-growing close genetic relative of the causative agent of tuberculosis, Mycolicibacterium (basonym: Mycobacterium) smegmatis, was used as the object of the study. Hydrophilic (PС 220) and hydrophobic (PС 154) forms of indotricarbocyanine dyes were used as photosensitizers. The maximum absorption band of photosensitizers is corresponded to 742 nm and the half-width is 70 nm, the maximum of the fluorescence spectrum is corresponded to at 758 nm, the half-width is 41 nm.

A daily culture of M. smegmatis cells (OD590 > 1) was diluted with NB medium to an optical density of OD590 = 0.2 and incubated with dyes for 2 hours at a temperature of 37 ° C in the dark with constant stirring. The illumination was carried out by 740 nm LED radiation (SOLIS-740C, Thorlabs, USA) at a power density of 260 mW/cm2. The exposure dose for the samples was 78, 234, 468 J/cm2, which corresponded to the illumination time of 5, 15 and 30 minutes. The viability of bacteria was analyzed by counting the number of colony forming units on agar medium.

As a result, it was revealed that at a concentration of 40 µM of the PC220 dye and a light dose of 468 J/cm2, cause a significant death of M. smegmatis cells (89%). At a light dose of 78 J/cm2, 50% of bacterial cells died. The use of the hydrophobic form of this photosensitizer demonstrated a more pronounced photodynamic effect. At a concentration of 40 µM of the PC154 dye and a light dose of 468 J/cm2, the number of M. smegmatis dead cells was 97%, probably due to better binding of PS to the hydrophobic wall of mycobacteria.

Thus, the conducted study demonstrates for the first time the possibility of in vitro photoinactivation of mycobacteria on the example of a fast–growing relative of the causative agent of tuberculosis - M. smegmatis using photosensitizers activated by radiation in the near infrared range. The development of this direction is promising to combat tuberculosis along with antibiotic therapy.

This study was funded by Russian Science Foundation grant 19-15-00324.