Цель исследования. Исследование продукции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами периферической крови, стимулированными зимозаном и липополисахаридом, распознающимися Toll-подобными рецепторами, у женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза на ранних сроках гестации по сравнению со здоровыми беременными женщинами.

Материалы и методы. Обследовано 75 женщин в возрасте 18-42 лет, которые были распределены на 3 группы: 1-я группа – здоровые небеременные женщины (n=25); 2-я группа - здоровые беременные женщины (n=25); 3-я группа - женщины с невынашиванием беременности инфекционного генеза (n=25). Все беременные женщины находились в первом триместре гестации (5-12 неделя). Определение функциональной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ) периферической крови проводили методом люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛХЛ).

Результаты исследования. На первом этапе исследования для выявления максимально действующей концентрации зимозана и липополисахарида (ЛПС) нами с использованием крови здоровых небеременных женщин была изучена зависимость интенсивности ЛХЛ ПЯЛ периферической крови от концентрации добавляемого лиганда при постоянном количестве клеток. Обнаружено дозозависимое изменение интенсивности ЛХЛ ПЯЛ. Максимальное значение интенсивности наблюдалось при концентрации зимозана, равной 100 мкг/мл, а ЛПС – 200 мкг/мл. Для выявления достоверных различий в ответах клеток исследуемых групп пациенток на основании полученных результатов были выбраны следующие концентрации зимозана и ЛПС: 5, 50 и 100 мкг/мл. Далее у здоровых беременных женщин и женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза было изучено влияние этих лигандов на интенсивность ЛХЛ ПЯЛ периферической крови. Обнаружено, что интенсивность ЛХЛ ПЯЛ возрастает в обеих группах пациенток с увеличением концентрации зимозана от 5 до 100 мкг/мл. При этом у женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза интенсивность ЛХЛ клеток при их стимуляции зимозаном в концентрации 100 мкг/мл в 1,5 раз (p<0,05) больше по сравнению со здоровыми беременными женщинами. В случае стимуляции клеток ЛПС с увеличением концентрации лиганда в исследуемых группах пациенток наблюдается выраженное различие в ответах клеток. Возрастание интенсивности ЛХЛ ПЯЛ с увеличением концентрации ЛПС от 5 до 100 мкг/мл наблюдается только у женщин с физиологической беременностью. У женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза интенсивность ЛХЛ ПЯЛ возрастает лишь при концентрациях от 5 до 50 мкг/мл, а дальнейшее увеличение концентрации ЛПС до 100 мкг/мл приводит к снижению интенсивности ЛХЛ ПЯЛ. При этом интенсивность ЛХЛ клеток, стимулированных ЛПС в концентрации 100 мкг/мл у женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза в 3,1 раз меньше (p<0,05), чем у женщин с физиологической беременностью. Можно предположить, что одной из причин уменьшения продукции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами, стимулированных большими концентрациями ЛПС, у женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза по сравнению с женщинами с физиологической беременностью является снижение экспрессии TLR4 (Toll-подобных рецепторов) на мембране этих клеток. При хронической инфекции постоянная стимуляция рецептора инфекционными агентами, возможно, вызывает угнетение TLR4, снижает экспрессию этого рецептора и уже на следующий стимул этими же лигандами наблюдается лишь угнетение клеточного ответа, уменьшается продукция активных форм кислорода. В результате происходит снижение бактерицидной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов у женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза, что может являться одним из механизмов развития невынашивания беременности.

При проведении сравнительного анализа влияния лигандов TLR2 (зимозана) и TLR4 (ЛПС) на продукцию активных форм кислорода наблюдаются следующие различия: максимальное значение интенсивности ЛХЛ ПЯЛ у женщин с физиологической беременностью при стимуляции их свечения зимозаном в концентрации 100 мкг/мл в 2,2 раза выше (p<0,05), по сравнению со стимуляцией клеток ЛПС. У женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза это различие существенно: интенсивность ЛХЛ ПЯЛ, стимулированных зимозаном в концентрации 100 мкг/мл в 10,7 раз выше (p<0,05), по сравнению со стимуляцией клеток ЛПС такой же концентрации. Нельзя исключить, что заметный вклад в общую продукцию активных форм кислорода фагоцитами крови у женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза может вносить TLR2-опосредованная продукция активных форм кислорода.

Заключение. У женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза и у здоровых беременных женщин на фоне развития оксидативного стресса в первом триместре гестации продукция активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами периферической крови, стимулированными зимозаном или липополисахаридом, распознающимися Toll-подобными рецепторами, может зависеть от экспрессии этих рецепторов на мембране клеток.

Ключевые слова: полиморфно-ядерные лейкоциты, зимозан, липополисахарид, хемилюминесценция, Toll-подобные рецепторы

Purpose of the study. The production of reactive oxygen species by peripheral blood polymorphonuclear leukocytes stimulated with zymosan and lipopolysaccharide, recognized by Toll-like receptors, in women with miscarriage of infectious genesis in the early stages of gestation compared with healthy pregnant women was studied.

Materials and methods. We examined 75 women aged 18–42 years, who were divided into 3 groups: group 1 - healthy non-pregnant women (n = 25); 2nd group - healthy pregnant women (n = 25); Group 3 - women with infectious miscarriage (n = 25). All pregnant women were in the first trimester of gestation (weeks 5–12). Determination of the functional activity of polymorphonuclear leukocytes (PNL) of peripheral blood was carried out by the method of luminol-dependent chemiluminescence (LCL).

Research results. At the first stage of the study, to determine the maximum effective concentration of ligands, we used the blood of healthy non-pregnant women to study the dependence of the intensity of LCL PNL on the concentration of the added ligand with a constant number of cells. In various studies, different amounts of zymosan and lipopolysaccharide (LPS) are used to study the functional activity of cells by the LCL assay. A dose-dependent change in the intensity of LCL PNL was detected. The maximum intensity was observed at a zymosan concentration of 100 μg/ml, and LPS at 200 μg/ml. On the basis of the obtained results, the following concentrations of zymosan and LPS were selected: 5, 50, and 100 μg/ml to identify significant differences in the responses of the cells of the studied patient groups. Further, in healthy pregnant women and women with infectious genesis miscarriage, the effect of these ligands on the intensity of LCL PNL was studied. The intensity of LCL PNL increases in both groups of patients with an increase in zymosan concentration from 5 to 100 μg/ml. At the same time, in women with miscarriage of infectious genesis, the intensity of LCL cells, when stimulated with zymosan at a concentration of 100 μg/ml, is 1.5 times (p<0.05) more than in healthy pregnant women. In the case of stimulation of LPS cells with an increase in the concentration of ligand in the studied groups of patients, a marked difference in the cell responses is observed. An increase in the intensity of LCL PNL with an increase in the concentration of LPS from 5 to 100 µg/ml is observed only in women with a physiological pregnancy. In women with miscarriage of infectious genesis, the intensity of LCL PNL increases only at concentrations from 5 to 50 µg/ml, and a further increase in the concentration of LPS to 100 µg/ml leads to a decrease in the intensity of LCL PNL. At the same time, the intensity of LCL PNL stimulated by LPS at a concentration of 100 μg/ml in women with miscarriage of infectious genesis is 3.1 times less (p<0.05) than in women with a physiological pregnancy. It can be assumed that one of the reasons for a decrease in the production of ROS PNL stimulated by large concentrations of LPS in women with miscarriage of infectious genesis compared with healthy non-pregnant women and women with physiological pregnancy is reduced expression of TLR4 (Toll-like receptors) on the membrane of these cells. In chronic infection, constant stimulation of the receptor by infectious agents, possibly, causes TLR4 inhibition, decreases expression of this receptor, and already for the next stimulus with these same ligands, only the inhibition of the cellular response is observed, and reactive oxygen species production decreases. As a result, there is a decrease in the PNL bactericidal activity in women with miscarriage of infectious genesis, which may be one of the mechanisms for the development of miscarriage. When conducting a comparative analysis of the effect of TLR2 and TLR4 ligands on the production of reactive oxygen species, the following differences are observed: the maximum intensity of LCL PNL in women with physiological pregnancy while stimulating their luminescence with zymosan at a concentration of 100 μg/ml is 2.2 times higher (p<0.05), compared with the stimulation of LPS cells. In women with infectious genesis miscarriage, this difference is significant: the intensity of LCL PNL stimulated by zymosan at a concentration of 100 µg/ml is 10.7 times higher (p<0.05), compared with stimulation of LPS cells of the same concentration. It cannot be ruled out that TLR2-mediated production of ROS may make a significant contribution to the overall production of ROS by blood phagocytes in women with infectious diseases miscarriage.

Conclusion. In women with miscarriage of infectious genesis and in healthy pregnant women against the background of the development of oxidative stress in the first trimester of gestation, the production of reactive oxygen species by polymorphonuclear leukocytes of peripheral blood stimulated by zymosan or lipopolysaccharide recognized by Toll-like receptors may depend on the expression of these receptors on cell membrane.

Key words: polymorphonuclear leukocytes, zymosan, lipopolysaccharide, chemiluminescence, Toll-like receptors