Одной из наиболее эффективных форм поддержания стабильности синаптической передачи является модуляция вызванного освобождения медиатора, в том числе и путем ауторегуляции секреторного процесса. В нервно-мышечном синапсе позвоночных в ауторегуляции освобождения ацетилхолина задействованы разные типы холинорецепторов, никотиновых и мускариновых, что предполагает возможность модуляции нейросекреции посредством целого ряда сигнальных путей.

Известно, что никотиновые и мускариновые холинорецепторы являются мишенями для свободных радикалов, которые могут образовываться в нервных и мышечных клетках при повышенной активности и воздействовать на различные мишени в области синаптического контакта. Хотя внутриклеточные АФК традиционно связывают с оксидативным стрессом, в нормальных физиологических условиях они необходимы и играют роль сигнальных мессенджеров в широком спектре клеточных процессов, например, участвуя в поддержании гомеостатической пластичности нейронов для сопряжения клеточного метаболизма с активностью синапсов (Accardi et al., 2014; Diebold and Chandel, 2016).

В работе исследовали эффекты блокады мускариновых рецепторов М1 подтипа на амплитудно-временные параметры потенциалов концевой пластинки (ПКП) при низкой и высокой частоте стимуляции двигательного нерва. Исследования проводились на изолированных нервно-мышечных препаратах диафрагмальной мышцы мыши линии BALB/c. ПКП регистрировали внутриклеточно с использованием стандартной микроэлектродной техники. Мышечные сокращения блокировали µ-конотоксином GVIB (Peptide InstituteInc., Japan).

В присутствии селективного блокатора рецепторов М1 подтипа VU-0255035 (0.1 мкM, Tocris) при стимуляции нерва с частотой 50 и 70 Гц наблюдалась более выраженная депрессия амплитуд ПКП по сравнению с контролем. Так, при стимуляции с частотой 70 Гц снижение составило 43.0±3.6% уже к 15 стимулу в пачке по сравнению с 26.0±2.1% в контроле. Однако к 40 стимулу разница в выраженности депрессии становилась незначительной. Интересно отметить, что снижение амплитуд ПКП при высокочастотной стимуляции сопровождалось увеличением длительности переднего фронта ПКП в интактных препаратах, а после инактивации М1 рецепторов это увеличение времени роста ПКП отсутствовало, а для первых десяти ПКП в пачке импульсов наблюдалось даже небольшое укорочение времени роста ПКП. Стимуляция нерва с частотой 10 и 20 Гц приводила к одинаковой депрессии амплитуд ПКП в контрольных препаратах и при инактивации М1 рецепторов, а также к одинаковому изменению длительности переднего фронта ПКП.

Для повышения уровня внутриклеточных АФК, в частности, супероксида, использовали антимицин А – антибиотик, селективно блокирующий цитохром-bc1-комплекс — центральный фермент в дыхательной цепи переноса электронов (Accardi et al., 2014). Инкубирование нервно-мышечного препарата в течение 15 мин в растворе, содержащим антимицин А (5 мкМ) не вызывало изменений параметров ПКП при низкочастотной стимуляции нерва. При кратковременной ритмической стимуляции с частотой 10 Гц (в течении 1 с) синаптическая депрессия после инкубации с антимицином А была менее выражена, чем в контроле (к 40му ПКП: 79.1±2.3% от амплитуды 1-го ПКП по сравнению с 73.9±0.9%). При частоте стимуляции нерва 70 Гц достоверных различий в развитии синаптической депрессии между интактными препаратами и препаратами, инкубированными с антимицином А, отмечено не было.

После предварительной инкубации препарата в антимицине А блокада М1 рецепторов приводила к менее выраженным изменениям амплитуды ПКП в ходе пачки импульсов. Время роста ПКП в ходе пачки импульсов при этом изменялось так же, как в контрольных препаратах. Таким образом, повышение продукции внутриклеточных АФК препятствовало развитию эффектов блокады М1 рецепторов на амплитуду и длительность переднего фронта ПКП при высокочастотной активности. Возможным объяснением этого феномена может быть как прямое действие внутриклеточных АФК на холинорецептор, так и то, что активация М1 рецепторов может регулировать нейросекрецию через изменение редокс-статуса нервного окончания. Выяснение этого механизма является предметом дальнейших исследований.



Исследование выполнено при поддержке государственного бюджета в рамках государственного задания ФИЦ КазНЦ РАН.

One of the most effective forms of maintaining the stability of synaptic transmission is the modulation of evoked neurotransmitter release including autoregulation of the secretory process. In the neuromuscular synapse of vertebrates, autoregulation of acetylcholine release involves different types of cholinergic receptors, nicotinic and muscarinic, which suggests the possibility of modulating of neurosecretion through a number of signaling pathways.

It is known that nicotinic and muscarinic cholinoreceptors are targets for free radicals, which production can be elevated in nerve and muscle cells during increased activity and affect various targets in the area of synaptic contact. Although intracellular ROS are traditionally associated with oxidative stress, under normal physiological conditions they are necessary, and play the role of signaling messengers in a wide range of cellular processes, for example, participating in the maintenance of homeostatic neuronal plasticity to couple cellular metabolism with synaptic activity (Accardi et al., 2014; Diebold and Chandel, 2016).

The effects of blockade of M1 muscarinic receptors on the amplitude and temporal parameters of endplate potentials (EPPs) at low and high frequency of motor nerve stimulation were studied. The studies were carried out on isolated neuromuscular preparations of the BALB/c mice diaphragm muscle. EPPs were recorded intracellularly using standard microelectrode technique. Muscle contractions were blocked with µ-conotoxin GVIB (Peptide Institute Inc., Japan).

In the presence of selective M1 blocker VU-0255035 (0.1 μM, Tocris), a more pronounced depression of the EPP amplitudes was observed when the nerve was stimulated at a frequency of 50 and 70 Hz compared to the control. Thus, upon 70 Hz stimulation, the decrease was 43.0 ± 3.6% by the 15th stimulus in the train compared to 26.0 ± 2.1% in control. However, by the 40th stimulus, the difference in the severity of depression became insignificant. It is interesting to note that the decrease in EPP amplitudes during high-frequency stimulation was accompanied by an increase in the duration of the EPP rise time in intact preparations, and after the inactivation of M1 receptors, this increase in the EPP rise time was absent, and for the first ten EPPs in the pulse train, even a slight shortening of the EPP rising phase was observed. Nerve stimulation at 10 and 20 Hz led to the same depression of the EPP amplitudes in the control preparations and after the inactivation of M1 receptors, as well as to the same change in the duration of the EPP rise time.

Antimycin A, an antibiotic that selectively blocks the cytochrome-bc1-complex, the central enzyme in the respiratory electron transport chain, was used to increase the level of intracellular ROS, in particular, superoxide (Accardi et al., 2014). Incubation of the neuromuscular preparation for 15 min in antimycin A containing solution (5 μM) did not cause any changes in the parameters of EPPs during low-frequency nerve stimulation. With short-term rhythmic stimulation at 10 Hz frequency (1 s), synaptic depression after incubation with antimycin A was less pronounced than in control (by the 40th EPP in the train: 79.1±2.3% of the amplitude of the 1st EPP compared with 73.9±0.9%). At 70 Hz, no significant difference in the development of synaptic depression between intact preparations and preparations incubated with antimycin A wase observed. After preliminary incubation of mouse diaphragm with antimycin A, blockade of M1 receptors led to a less pronounced changes in the EPP amplitude during the pulse train. The EPP rise time during the train changed in the same way as in control preparations. Thus, an increase in the production of intracellular ROS prevented the development of the effects of M1 receptors blockade on the amplitude and rise time of EPPs during high-frequency activity. A possible explanation for this phenomenon can be both the direct effect of intracellular ROS on the muscarinic receptor, and the fact that M1 receptors activation can regulate neurosecretion through the modulation of the redox status of the nerve ending. Elucidation of this mechanism is the subject of further research.



The study was supported by state budget within the framework of State Assignment of Federal Research Center Kazan Scientific Center, Russian Academy of Sciences.