Болезнь Паркинсона (БП) является хроническим нейродегенеративным заболеванием, связанным с гибелью дофаминергических нейронов черной субстанции. Известно, что одним из путей развития БП, является митохондриальная дисфункция, которая сопровождается снижением их энергетической эффективности и развитием окислительного стресса. В нашей работе исследовалось влияние уридина на активность ключевого фермента митохондрий сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и цитозольной-лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в лимфоцитах крови на мазках, а также уровень малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови, в модели БП индуцированной ротеноном. Предшествующими работами нашей группы было показано, что уридин приводит к увеличению образования, в клетке, уридиндифосфата - активатора митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала (митоКАТФ-канал). Активация митоКАТФ-канала, приводит к снижению окислительного стресса [1,2], поэтому, мы использовали уридин в модели БП для лечения митохондриальной дисфункции у крыс.

Материалы и методы: Исследование проведено на самцах крыс (n=25) линии Вистар, весом 280-320 г, содержащихся на базе ИТЭБ РАН, с соблюдением правил Европейской конвенции по обращению с лабораторными животными. Для моделирования БП у крыс применяли раствор ротенона (SIGMA) в дозе 1,7 мг/кг веса животного, который вводили путем подкожного хронического введения на протяжении 28 дней, по схеме 2 дня введение, 2 дня перерыв. Ротенон является ингибитором клеточного дыхания, он блокирует перенос электронов с железосерных кластеров с комплекса I на убихинон. Уридин вводили внутрибрюшинно в концентрации 30 мг/кг веса животного, с периодичностью 2 дня введение, 2 дня перерыв.

Активности СДГ (биомаркера аэробного дыхания митохондрий) и ЛДГ (биомаркера анаэробного дыхания - гликолиза) проводили ЦБХ методом в иммобилизованных лимфоцитах крови на мазках [3]. ЦБХ метод основан на реакции восстановления нитросинего тетразолия хлорида до темно-синего диформазана (ДФ) на втором участке дыхательной цепи митохондрий. Тонкие мазки крови фиксировали в течение 30 сек 60 % ацетоном и 10 мМ НEPES, рН 5,2-5,4, затем окрашивали в среде инкубации содержащей: 125 мМ КСl, 10 мМ HEPES, 1,22 мМ НСТ в течение 1 часа при 37°С, рН 7,2 ±0,05 и добавки; 5мМ Succinic acid - основная проба, характеризующая активность СДГ и Lactic acid 5мМ, Malonic acid 5мМ и 0,5мМ NAD - активность ЛДГ. Мазки изучали при увеличении 1000Х на микроскопе Лейка DM-2000. Цитоморфологический и количественный анализ цветных микрофотографий лимфоцитов проводили программами «Bloodrunner» и «Cell Composer», позволяющих определять количество и распределение красителя ДФ в каждой клетке. Уровень перекисей липидов, определяли по МДА, в сыворотке крови, с тиобарбитуровой кислотой диагностическим набором «ТБК-АГАТ». Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного программного обеспечения Microsoft Office Exсel-2007 и Statistica 10.0. Оценка значимости различий данных между группами, проводилась с использованием t- критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при значениях *p<0,05.

Результаты. Подкожное ведение ротенона крысам, для моделирования БП, привело к достоверному (р≤0,05) увеличению в 2 раза активности СДГ (контроль 1,3 ±0,37 у.е.; БП 2,4 ±0,85 у.е. (у.е.- количество ДФ)), и активности ЛДГ, которая также увеличивалась в 2 раза (р≤0,01) (контроль 2,24 ±1,19; БП 3,9 ±1,0 у.е). Введение уридина достоверно снижало на 25 % повышенную активность СДГ (гиперактивацию митохондрий), по-видимому, за счет механизма активации митоКАТФ-канала, но не повлияло на активность цитозольной ЛДГ. Измерение радиуса лимфоцитов, у больных и контрольных животных, без разделения их на субпопуляции, не имело достоверных отличий. Однако в группе с уридином размер лимфоцитов достоверно увеличился по сравнению с контролем (контроль 3,2 ±0,2; уридин 3,9 ±0,4 µм2). Размах вариативности размеров лимфоцитов, на фоне введения уридина, был шире, чем у контрольных животных. Определение МДА в сыворотке крови у животных с БП достоверно выше в 2 раза, чем в группе контроль (контроль 4,44 ±0,85; БП 7,68 ±1,34 мМоль/л, р≤0,01), а введение больным животным уридина, снижает этот показатель в 2,5 раза до уровня ниже контрольного (БП + уридин 2,72 ±0,67 мМоль/л, р≤0,01). Подобное действие уридина, как фактора, снижающего окислительный стресс, было показано и в других работах нашей группы [1]. Известно, что ротеноновая модель - одна из экспериментальных моделей БП, которая вызывает нигростриальную дегенерацию, вызванную ингибированием комплекса I дыхательной цепи митохондрий и появлением телец Леви. В нашей работе, на этой модели, впервые обнаружено существенное увеличение активности СДГ и ЛДГ т.е. повышение как аэробного, так и анаэробного дыхания в лимфоцитах крови, а также увеличение уровня МДА в сыворотке крови, что подтверждает развитие у этих животных окислительного стресса. Введение уридина - активатора митоКАТФ-канала животным с БП, приводило к снятию гиперактивации СДГ митохондрий лимфоцитов крови на 25%, и значительному снижению уровня перекиси липидов в сыворотке. Эти данные подтверждают наше предположение, что уридин уменьшает окислительный стресс и нормализует функцию митохондрий в лимфоцитах, что позволяет его рекомендовать для профилактики и лечения БП.

Работа поддержана грантом РНФ №23-25-00441

Список литературы

1. Кветной И.М., Миронова Е.С., Крылова Ю.С. и др. Молекулярная медицина 2022, т. 20, №1, 25-28

2. Мосенцов А.А. и др. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2020, т. 170, № 10, 438

3. Хундерякова Н.В., Захарова Н.М. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2020, т. 169, № 4. 426–430

4. Ставровская А.В. и др. Нейрохимия, №3. 2020

Parkinson's disease (PD) is a chronic neurodegenerative disease associated with the death of dopaminergic substantia nigra neurons. It is known that one of the causes of PD is mitochondrial dysfunction associated with a decrease in their energy efficiency and the development of oxidative stress. In our work, the effect of uridine on the activity of the key mitochondrial enzyme succinate dehydrogenase (SDH) and cytosolic -lactate dehydrogenase (LDH) in blood lymphocytes on smears and on serum malondialdehyde (MDA) levels in rotenone-induced parkinsonian model was investigated. Previous works by our group has shown that uridine leads to an increase in the formation of uridine diphosphate in the cell, an activator of mitochondrial ATP-dependent potassium channel (mitoKATP-channel). Activation of mitoKATP-channel leads to a decrease in oxidative stress [1, 2], which is why we used uridine in the PD model to treat mitochondrial dysfunction in rats.

Materials and Methods: The study was performed on male Wistar rats (n=25) weighing 280-320 g, kept at the ITEB RAS in compliance with the rules of the European Convention for the Treatment of Laboratory Animals. To simulate PD in rats, a rotenone solution (SIGMA) was used at a dose of 1.7 mg/kg animal weight, administered by subcutaneous chronic injection for 28 days, according to the scheme of 2 days of dosing, 2 days of rest. Rotenone is a cellular respiration inhibitor; it blocks electron transfer from glandular clusters of complex I to ubiquinone. Uridine was administered intraperitoneally at a concentration of 30 mg/kg animal weight with a frequency of 2 days of dosing and 2 days of rest.

The activities of SDH (a biomarker of aerobic mitochondrial respiration) and LDH (a biomarker of anaerobic respiration - glycolysis) were measured by the CBC method in immobilized blood lymphocytes on smears [3]. The CBC method is based on the reduction reaction of nitroblue tetrazolium chloride to dark blue diformazan (DF) at the second site of the mitochondrial respiratory chain. Thin blood smears were fixed for 30 sec with 60 % acetone and 10 mM HEPES, pH 5.2 - 5.4, then stained in incubation medium containing: 125 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.22 mM NST for 1 hour at 37°C, pH 7.2 ±0.05 and additives; 5mM succinic acid was the main assay to characterize LDH activity and 5mM lactic acid, 5mM malonic acid and 0.5mM NAD - LDH activity. Smears were studied under 1000X magnification using a Leica DM-2000 microscope. Cytomorphological and quantitative analysis of color micrographs of lymphocytes was performed using the "Bloodrunner" and "Cell Composer" programs to determine the amount and distribution of DF dye in each cell. The level of lipid peroxides in blood serum was determined by MDA with thiobarbituric acid using diagnostic kit "TBK-AGAT". Statistical data processing was performed using licensed Microsoft Office Exсel-2007 and Statistica 10.0 software. The significance of differences between the groups was determined using Student's t-test. Differences were considered significant at values *p<0.05.

Results. Subcutaneous dosing of rotenone to rats to simulate PD resulted in a significant (p≤0.05) 2-fold increase in SDH activity (control 1.3 ±0.37 unit; PD 2.4 ±0.85 unit (unit - amount of DF)), and LDH activity, which also increased 2-fold (p≤0.01) (control 2.24 ±1.19; PD 3.9 ±1.0 unit). Uridine administration significantly reduced the increased SDH activity (mitochondrial hyperactivation) by 25 %, apparently due to the mechanism of mitoKATP-channel activation, without an effect on cytosolic LDH activity. Measurement of the radius of lymphocytes in sick and control animals, without dividing them into subpopulations, revealed no significant differences. However, the size of lymphocytes increased significantly in the group with uridine compared to the control animals (control 3.2 ±0.2; uridine 3.9 ±0.4 µm2). The range of variation in lymphocyte size was greater than in control animals against a background of uridine administration. The determination of MDA in blood serum was significantly 2-fold higher in animals with PD than in the control group (control 4.44 ±0.85; PD 7.68 ±1.34 mMol/L, p≤0.01), and administration of uridine to sick animals, reduced this index 2.5-foldto a level lower than that of the control group (PD + uridine 2.72 ±0.67 mMol/L, p≤0.01). A similar effect of uridine as a factor in reducing oxidative stress has been shown in other work by our group [1]. It is known that the rotenone model is one of the experimental models of PD, which causes nigrostriatal degeneration caused by inhibition of complex I of the mitochondrial respiratory chain and the appearance of Levy bodies. In our work, we first detected a significant increase in the activity of SDH and LDH in this model, i.e., an increase in both aerobic and anaerobic respiration in blood lymphocytes, as well as an increase in the serum MDA level, which confirms the development of oxidative stress in these animals. Administration of uridine, an activator of the mitoKATP-channel, resulted in a 25 % reduction in SDH hyperactivation in blood lymphocyte mitochondria and a significant decrease in serum lipid peroxide levels in animals with PD. These data support our hypothesis that uridine reduces oxidative stress and normalizes mitochondrial function in lymphocytes, so it can be recommended for the prevention and treatment of PD.

This work was supported by RNF grant №23-25-00441

References:

1. Kvetnoi I.M. et al. Molecular Medicine. 2022. v. 20. №. 1, P. 25-28

2. A.A. Mosentsov et al. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2020. v. 170. №. 10, P. 438

3. Khunderyakova N.V., Zakharova N.M. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2020, 169, №4, 426–30.

4. Stavrovskaya, A.V. et al. Neurochemistry. 2020. №. 3.