Есть два вопроса, ответы на которые необходимы для выяснения механизма физиологического воздействия NO. Это вопросы о специфичности физиологического воздействия NO и о предотвращении его окисления до токсического нитрита. Живые ткани богаты SH- группами, и если NO будет высвобождаться спонтанно, то его взаимодействие с физиологически значимой мишенью маловероятно . Также, поскольку NO – короткоживущее соединение, быстро окисляющееся до нитрита, необходим механизм, предохраняющий NO от окисления кислородом.

Считается, что есть соединения – доноры NO: S-нитрозотиолы (RSNO), динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ), которые продлевают физиологическое время жизни NO [1]. Но как осуществляется специфичность взаимодействия, а также защита высвободившегося NO от окисления до нитрита, неясно. Одна из причин — отсутствие метода, позволяющего оперативно контролировать состав метаболитов NO в живых тканях [2, 3].

Разработанный нами в соавторстве с ИХФ РАН ферментный сенсор дает такую возможность. Он основан на обратимом ингибировании фермента каталазы всеми нитрозосоединениями и нитритом с примерно равной эффективностью, которая на два порядка возрастает в присутствии хлорида в плазменной концентрации, а также бромида и тиоцианата. ДНКЖ теряют ингибирующую способность в среде, содержащей хелатор железа (о-фенантролин, ЭДТА) и ловушку NO (гемоглобин), перехватывающую высвобождающийся из комплекса оксид азота. RSNO трансформируются в ДНКЖ под воздействием закисного железа и приобретают его свойства. Нитрит (NO2-) и нитрозоамины, практически, не продуцируют ДНКЖ в нейтральной среде и сохраняют ингибирующие способности при последовательном добавлении закисного железа, глютатиона, ловушки NO и хелатора железа. Активность каталазы измерялась калориметрически — по кинетике теплопродукции, сопровождающей этот высокоэкзотермический процесс (23,6 ккал/МН2О2). Такая регистрация не требует предварительной очистки образца. Чувствительность метода – 40 нМ, что превышает чувствительность ЭПР и фотометрических методов [3]. То есть мы можем оперативно контролировать состав основных метаболитов NO.

Согласно данным ферментного сенсора, большинство живых тканей содержит нитрит в концентрации менее 50 нМ, несмотря на то, что, согласно данным теста Грисса, в них содержался нитрит в концентрации до нескольких сотен нМ [3]. Нитрит, экзогенно добавленный к исследуемым образцам, определялся сенсором как нитрит. Следовательно, исходно в образцах присутствовал не нитрит, но какие-то соединения, имеющие NO-группы. Показано, что соединения — доноры NO: RSNO, ДНКЖ способны давать окрашенный продукт при взаимодействии с реактивом Грисса в кислой среде. По-видимому, в кислой среде происходит их распад с высвобождением NO и окислением до нитрита. Концентрация соединений-доноров NO в живых тканях варьирует от единиц до десятков и сотен мкМ [3]. Интенсификация синтеза NO после ввода аргинина не приводила к появлению нитрита [4]. Следовательно, ткани имеют механизм предотвращения окисления NO до нитрита. Можно предположить, что синтезированная молекула NO сразу включается в состав соединений — доноров. Последние считаются короткоживущими соединениями [1,2]. Но сопоставление данных ферментного сенсора и данных ЭПР, относительно концентрации ДНКЖ, а также спектральных методов, относительно ДНКЖ, RSNO показывает, что эти соединения могут модифицироваться, терять свои спектральные и ЭПР — свойства, но, практически, не распадаются спонтанно с высвобождением NO так как не теряют свои специфические ингибирующие свойства [3].

Но каким образом происходит переход NO с молекулы — донора на мишень. Доноры NO не теряют своих ингибирующих свойств при инкубации с гемоглобином — ловушкой NO. ДНКЖ полностью теряет свойство ингибировать каталазу в системе, содержащей ловушку NO и хелатор железа, превосходящий по эффективности лиганды, входящие в состав комплекса. Например, в случае если в состав комплекса входит глутатион (ДНКЖ/GSH), то комплекс терял ингибирующие свойства в системе цистеин- гемоглобин. ДНКЖ/GSH окисляется в эмбрионах птиц до нитрата, а комплекс, имеющий цистеин (ДНКЖ/Cys) – не не окисляется так как не усваивается тканями [4]. Следовательно, переход NO с молекулы донора на мишень происходит при наличии этой мишени и деструкции комплекса. Мы предполагаем, что деструкция может осуществляться под действием каких-то групп, входящих в состав самой мишени. Эндогенно синтезируемые ДНКЖ имеют ингибирующие свойства ДНКЖ/GSH. RSNO, предположительно, осуществляют функцию доноров NO, трансформируясь до ДНКЖ [3].

Нами показано, что в эмбрионах сельскохозяйственных птиц одного вида, но разных пород оксид азота синтезируется с, примерно, равной интенсивностью, но интенсивность окисления до нитрата у пород мясного направления продуктивности многократно выше, чем у пород яичного направления. У последних NO накапливается в эмбрионе в составе соединений — доноров [4].

Таким образом, физиологическая эффективность NO определяется наличием мишени, имеющей химическое сродство к NO и индуцирующей распад доноров NO, но не спонтанным распадом последних. По-видимому, при переходе с донора на мишень NO минимально пребывает в свободном состоянии и не успевает окислиться.

Литература.

1. Vanin A. Dinitrosyl iron complexes with thiolate ligands: Physico-chemistry, biochemistry and physiology. // Nitric Oxide, 2009, v. 21, p.1–13.

2. Tarpey M., Wink D., Grisham M. Methods for detection of reactive metabolites of oxygen and nitrogen: in vitro and in vivo considerations. // Am. J. Physiol. Regul. Integr Comp. Physiol., 2004, v. 286, p. R 431-R444.

3. Titov V., Osipov A. Nitrite and Nitroso Compounds can serve as Specific Catalase Inhibitors // Redox Rep, 2017, Vol. 22, N 2, p. 91-97.

4. Titov V.Yu., Dolgorukova A.M., Fisinin V.I., Borkhunova Ye.N., Kondratov G.V., Slesarenko N.A., Kochish I.I. The role of nitric oxide (NO) in the body growth rate of birds.// World Poultry Science Journal, 2018, v.74, N 4, p. 675-686.

There are two questions, the answers to which are necessary for clarification of the mechanism of NO physiological effect. These are mechanisms of specificity of NO physiological effects and prevention of NO oxidation to toxic nitrite. Living tissues contain many SH-groups. If NO is released spontaneously, its interaction with a physiologically significant target is low probable. Since NO is a short-living compound quickly oxidizing to nitrite, defense NO from oxidation by oxygen is necessary.

S-nitrosothiols (RSNO) and dinitrosyl iron complexes (DNIC) are considered as NO donors that prolong NO physiological lifetime [1]. But the ways of realization of the NO interaction specificity and the defense from its oxidation to nitrite it is not yet clear. One of the reasons is the absence of a method enabling a prompt monitoring of NO metabolite content of living tissues. [2, 3].

An enzymic sensor developed by us in collaboration with ICP RAS gives such ability. The method is based on the reversible inhibition of the catalase by all nitroso compounds and nitrite with an approximately equal efficiency that increases by two orders in the presence of chloride in plasma concentration as well as bromide and thiocyanate. DNIC lose the inhibiting ability in a system containing an iron chelator (о-phenanthroline, EDTA) and NO trap (hemoglobin) intercepting NO released from the complex. RSNO transform to DNIC under the action of ferrous ion and acquire DNIC properties. Nitrite (NO2-) and nitrosoamines practically produce no DNIC in a neutral medium and retain the inhibiting abilities under sequential addition of ferrous ion, glutathione, NO trap and iron chelator. The activity of catalase was measured calorimetrically by recording the kinetics of heat production accompanying that highly exothermic process (23.6 kcal/МН2О2). Such recording requires no preliminary sample purification. The sensibility of the method is 40 nМ which exceeds that of EPR and photometric methods [3]. Thus, the content of basic NO metabolites can be promptly monitored.

According to the sensor data, the majority of living tissues contained nitrite in concentration below 50 nМ in spite of the fact that, according to the data of the Griss test, they contained nitrite in a concentration of up to several hundred nМ [3]. Nitrite, added exogenously to their samples, was determined by the sensor as nitrite. Therefore, the samples contained not nitrite but some compounds having NO-groups. It is shown that NO donors (RSNO, DNIC) produce a dyed product with the Griss reagent in acid medium that is necessary for the reaction. They appear to be decomposed in the acidic medium with the NO releasing and oxidation to nitrite. The concentration of NO donor compounds in living tissues varies from units to hundreds µМ [3]. The intensification of NO synthesis after the introduction of arginine not result in the appearance of nitrite [4]. Therefore, living tissues have a mechanism to prevent NO oxidation to nitrite. It can be assumed that a synthesized NO molecule is immediately included in the donor compounds. The latter are considered to be short-living compounds [1, 2]. Nevertheless, the comparison of the sensor and EPR data with respect to DNIC, as the sensor and spectral data in respect to DNIC and RSNO, shows that these compounds can be modified, lose their spectral and EPR properties, but do not practically decompose spontaneously with the release of NO since they do not lose their specific inhibiting properties [3].

But, how the transition of NO from a donor molecule to a target can be occurs? NO donors do not lose their specific inhibiting properties during the incubation with NO trap hemoglobin. A DNIC completely loses the inhibiting property in the system containing NO trap and iron chelator exceeding by efficiency the ligands included in the complex. For instance, if the complex included glutathione (DNIC/GSH) it lost the inhibiting properties in the cysteine/hemoglobin system. DNIC/GSH is oxidized to nitrate in bird embryos, and a cysteine containing complex (DNIC/Cys) is not oxidized since it is not absorbed by tissues [4]. Therefore, the transition of NO from a donor to a target takes place in the presence of the target and destruction of the complex. It is supposed that the destruction may occur under the action of some groups included in the target. Endogenously synthesized DNIC have DNIC/GSH inhibiting properties. RSNO presumably perform the donor function by transforming to DNIC [3].

It is shown in our experiments that nitric oxide is synthesized with an approximately equal intensity in the poultry embryos of the same species. but the intensity of oxidation to nitate in breeds of meat direction productivity is many-fold higher than that of egg direction. In the latter, NO accumulates in the embryo as part of donor compounds [4].

Therefore, NO physiological efficiency is determined by the presence of a target that has chemical affinity to NO and induces decomposition of NO donors, but not by a spontaneous decomposition of the latter. It proposed that NO minimally stays in a free state when passes from a donor to a target.

References

1. Vanin A. Dinitrosyl iron complexes with thiolate ligands: Physico-chemistry, biochemistry and physiology. // Nitric Oxide, 2009, v. 21, p.1–13.

2. Tarpey M., Wink D., Grisham M. Methods for detection of reactive metabolites of oxygen and nitrogen: in vitro and in vivo considerations. // Am. J. Physiol. Regul. Integr Comp. Physiol., 2004, v. 286, p. R 431-R444.

3. Titov V., Osipov A. Nitrite and Nitroso Compounds can serve as Specific Catalase Inhibitors // Redox Rep, 2017, Vol. 22, N 2, p. 91-97.

5. Titov V.Yu., Dolgorukova A.M., Fisinin V.I., Borkhunova Ye.N., Kondratov G.V., Slesarenko N.A., Kochish I.I. The role of nitric oxide (NO) in the body growth rate of birds.// World Poultry Science Journal, 2018, v.74, N 4, p. 675-686.