Гипоксия головного мозга возглавляет список актуальных проблем мирового здравоохранения, требующих скорейшего разрешения. Запуск гипоксия-индуцированных патологических механизмов является не только причиной гибели клеток и значимых изменений функций мозга, но и одним их ключевых факторов, предопределяющих развитие тяжелых патологий ЦНС, включая ишемический инсульт, нейродегенеративные и онкологические процессы. Гипоксия оказывает свое губительное действие как на нейроны, так и на глиальные клетки, однако роль последних в адаптации мозга к дефициту кислорода исследована недостаточно. Глиальные клетки, в частности астроциты, и нейроны находятся в тесном динамическом взаимодействии и организованы в пластичные и жестко регулируемые сети. Астроцитарные сети, образующиеся с помощью gap-контактов коннексина, обладают сигнальной активностью и принимают активное участие в регуляции обмена между цитоплазмой и внеклеточным пространством. Gap-контакты астроцитов состоят из шести белковых субъединиц – коннексинов (Cx), среди которых коннексин 43 (Cx43) в основном обеспечивают связь между астроцитами в мозге. В недавних исследованиях было показано, что астроцитарные gap-контакты обеспечивают не только быстрый межклеточный обмен ионов и метаболитов, что имеет решающее значение для буферизации ионов K+ и глутамата, распространения кальциевых волн и синаптической пластичности, но и являются участниками развития повреждения при гипоксия-ишемических состояниях.

Целью настоящего исследования явилось подробное изучение влияния астроцитарных Cx43 в функциональной реорганизации нейрон-глиальных сетей при гипоксическом повреждении in vitro. Материалом для исследований служили первичные культуры клеток больших полушарий головного мозга мышей линии C57BL/6 18-го дня гестации. На 14 день развития культур in vitro проводилось моделирование острой нормобарической гипоксии посредством замены кондиционированной культуральной среды на среду с низким содержанием кислорода в течение 10 мин. Добавление селективного ингибитора Cx43 – Gap19 (10 мкМ, Sigma-Aldrich, Германия) в среду культивирования осуществлялось за 20 минут до моделирования гипоксии. Методом ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-qPCR) проведена оценка уровня экспрессии метаботропных глутаматных рецепторов mGluR2 и mGluR5 в клетках первичных кортикальных культур на 1 и 3 сутки после моделирования гипоксии. В отдаленном постгипоксическом периоде проведена регистрация спонтанной кальциевой активности методом кальциевого имиджинга и оценены сетевые характеристики первичных кортикальных культур с помощью оригинальных математических алгоритмов.

Было показано, что в условиях нормоксии блокада астроцитарных Cx43 приводит к повышению экспрессии метаботропных глутаматных рецепторов mGluR2 и mGluR5, а также длительной модуляции спонтанной кальциевой активности первичных культур клеток больших полушарий головного мозга, в первую очередь выражающаяся в реструктуризации функциональной архитектоники нейрон-глиальных сетей посредством снижения уровня корреляции между клетками сети и долей существующих корреляционных связей между клетками. Блокада Сх43 при гипоксическом повреждении оказывает выраженный нейропротекторный эффект. В отделенном постгипоксическом периоде на фоне сохраняющейся повышенной экспрессии mGluR5 рецепторов установлено снижение экспрессии mGluR2 до физиологического уровня, что предполагает запуск альтернативных молекулярных механизмов адаптации клеток к гипоксическому повреждению. Кроме того, блокада Cx43 способствовала поддержанию как основных параметров спонтанной кальциевой активности первичных культур (процент функционально активных клеток, длительность и частота Са2+ осцилляций), так и функциональной архитектоники нейрон-глиальной сети с сохранением профиля кальциевых осцилляций и высокого уровня корреляции кальциевых сигналов между клетками сети. Результаты исследования демонстрируют важное значение астроцитарных сетей в функциональной адаптации мозга к гипоксическому повреждению, что может стать перспективной мишенью для разработки стратегии рациональной антигипоксической терапии.

Исследование выполнено в рамках научной программы Национального центра физики и математики (проект «Искусственный интеллект и большие данные в технических, промышленных, природных и социальных системах).

Brain hypoxia continues to head the list of urgent global health problems that need to be resolved. The launching of hypoxia-induced pathological mechanisms is not only the cause of cell death and significant changes in brain functioning, but also one of the key factors predisposing the development of severe CNS pathologies, including ischemic stroke, neurodegenerative and oncological processes. Hypoxia has a detrimental effect on both neurons and glial cells, but the role of the latter in the brain's adaptation to oxygen deficiency has not been sufficiently investigated. Glial cells, in particular astrocytes, form bi-directional communications with neurons allowing the organization of plastic and tightly regulated networks. Astrocytic networks formed via gap junctions have signaling activity and take an active part in the regulation of exchange between the cytoplasm and the extracellular space. Gap junctions of astrocytes consist of six protein subunits, connexins (Cx), among which connexin 43 (Cx43) mainly provides the connection between astrocytes in the brain. Recent studies have shown that astrocytic gap junctions not only provide rapid intercellular exchange of ions and metabolites, which is crucial for the buffering of K+ ions and glutamate, Ca2+ wave propagation and synaptic plasticity but also are participants in the development of damage in hypoxia-ischemic states.

The goal of this study is focused on the detailed characterization of astrocytic Cx43 influence on the functional reorganization of neuron-glial networks in the hypoxia modelling in vitro. Primary cortical cultures obtained from the brains of C57BL/6 mice at day 18 of gestation were used as an object of the research. Acute normobaric hypoxia was modeled on day 14 of cultures development in vitro by replacing conditioned culture medium with a medium with a low-oxygen content for 10 min. Selective Cx43 inhibitor - Gap19 (10 µM, Sigma-Aldrich, Germany) was added to the culture medium 20 min before hypoxia modelling. The expression levels of metabotropic glutamate receptors mGluR2 and mGluR5 in primary cortical culture cells were assessed by quantitative real-time PCR method (RT-qPCR) on days 1 and 3 after hypoxia simulation. In late post-hypoxic period, spontaneous calcium activity was recorded by calcium imaging technique and the network characteristics of primary cortical cultures were evaluated using original mathematical algorithms.

We showed that in normoxia, the blockade of astrocytic Cx43 caused an increased expression of mGluR2 и mGluR5 receptors expression as well as long-term modulation of spontaneous calcium activity of primary cortical cultures, primarily characterized by the restructuring of the functional architectonics of neuron-glial networks via reduction the correlation level between cells in the network and the proportion of existing correlated cell-to-cell connections. Blockade of Сх43 in the modeled hypoxia had a pronounced neuroprotective effect. In the late post-hypoxic period under the background of elevated mGluR5 receptor expression, the values of mGluR2 expression were found to decrease to physiological level, suggesting the activation of the alternative molecular mechanisms of cellular adaptation to hypoxic damage. Moreover, Cx43 blockade maintained the main parameters of spontaneous calcium activity of primary cortical cultures such as the percentage of functionally active cells, duration and frequency of Ca2+ oscillations and the functional architectonics of the neuron-glial network with preserved profile of calcium oscillations and high correlation level of calcium signals between cells in the network. The results demonstrate the crucial importance of astrocytic networks in functional brain adaptation to hypoxic damage, which could be a promising target for developing a strategy for rational antihypoxic therapy.

Research was carried out in the frame of the scientific program of the National Center for Physics and Mathematics (project “Artificial intelligence and big data in technical, industrial, natural and social systems”).