Лечение онкологических заболеваний является одной из самых сложных задач для медицины. Хорошо известно, что в онкологических клетках сложно инициировать апоптотические процессы, включение которых необходимо для их элиминации из организма. В связи с этим особое внимание исследователей и врачей сегодня привлекают механизмы контролируемой клеточной гибели и способы их регуляции.

Как известно, одним из методов, который увеличивает эффективность лечения онкологических заболеваний, является гипертермия. При гипертермии выполняется избирательное нагревание опухолевых тканей до температур в диапазоне от 39 до 45°C. Последние разработки, основанные на терморадиобиологическом обосновании гипертермии, указывают на то, что она является мощным радио - и хемосенсибилизатором [1]. Кроме того, применение гипертермии может быть разделено во времени с сеансом лучевой терапии (согласно рекомендациям примерно на час) и, конечно, остается вопросом, как объяснить усиление проапоптотических свободнорадикальных процессов после незначительного увеличения температуры и тем более сохранение этого эффекта при возвращении к исходным значениям температуры.

Цель настоящего исследования: изучение структурных и функциональных изменений цитохрома с (CytC) как одного из основных белков, инициирующих апоптотические процессы по митохондриальному пути, а также влияние температуры на цитохром с – зависимые апоптотические процессы. Исследование выполнены на молекулярном уровне при помощи методов спектрофотометрии, спектрофлуориметрии и хемилюминесценции комплексов цитохрома С с кардиолипином (CL), фосфатидной кислотой (PA) и фосфатидилхолином (PC), при температурах до 45℃.

Было обнаружено, что комплексы CytC с PA или CL характеризуются увеличением интенсивности флуоресценции триптофана 59 примерно в 1.7 раза. Изменение интенсивности полосы 695 нм цитохрома с наблюдается только в присутствии CL содержащих липосом (на ~13.7% при 25℃, ~19.4% при 37℃ и ~21.4% при 45℃), но отсутствует как в присутствии PC, так и PA. Интенсивность хемилюминесценции при повышении температуры с 25 до 37℃ в присутствии PA увеличивается на 26%. При переходе с 37 на 45℃ увеличения интенсивности хемилюминесценции Cyt C в присутствии фосфолипидов обнаружено не было. Особенно интересно, что и методами спектрофлуориметрии, и при оценке цитохром с - индуцированного ПОЛ (хемилюминесценция с кумарином) было показано явление гистерезиса при нагревании комплексов CytC c анионными фосфолипидами. Данное явление проявлялось в том, что структурные и функциональные свойства цитохрома с при его нагревании до 45С с последующим охлаждении до 25С значимо отличались (примерно до 26%) от аналогичных образцов, которые не подвергались предварительному нагреванию, а просто измерялись при 25С.

Таким образом, показано, что: 1. Увеличение температуры изменяет конформацию и пероксидазную активность CytC; 2. Пероксидазная активность в присутствии анионных фосфолипидов возрастает; 3. Температурная инкубация CytC с PA и CL привела к необратимым конформационным изменениям, в отличие от контрольного PC, что может служить объяснением молекулярных механизмов эффекта гистерезиса, который провялятся при проведении гипертермии и даже затрагивает рекомендации по его применению.



Библиографические ссылки

1. Datta NR, et al. Local hyperthermia combined with radiotherapy and-/or chemotherapy: recent advances and promises for the future. Cancer Treat Rev. 2015.

The treatment of oncological diseases is one of the most difficult tasks for medicine. It is well known that it is difficult to initiate apoptotic processes in cancer cells, the inclusion of which is necessary for their elimination from the body. In this regard, the mechanisms of controlled cell death and ways of their regulation attract special attention of researchers and doctors today.

As you know, one of the methods that increases the effectiveness of cancer treatment is hyperthermia. In hyperthermia, the tumor tissues are selectively heated to temperatures ranging from 39 to 45 ° C. Recent studies based on the thermoradiobiological justification of hyperthermia indicate that it is a powerful radio and chemosensitizer [1]. In addition, the use of hyperthermia can be separated in time with a radiation therapy (according to the recommendations for about an hour) and, of course, the question how to explain the intensification of pro-apoptotic free radical processes remains. After a slight increase in temperature the effectivities therapy and especially the preservation of this effect when returning to the initial temperature values.

The purpose of this study: to investigate the structural and functional changes of cytochrome c (CytC) as one of the main proteins initiating apoptotic processes along the mitochondrial pathway, as well as the effect of temperature on cytochrome c–dependent apoptotic processes. The study was performed at the molecular level using spectrophotometry, spectrofluorometry and chemiluminescence of cytochrome C complexes with cardiolipin (CL), phosphatidic acid (PA) and phosphatidylcholine (PC), at temperatures up to 45℃.

It was found that CytC complexes with PA or CL are characterized by an increase in the fluorescence intensity of tryptophan 59 by about 1.7 times. A change in the intensity of the 695 nm cytochrome c band is observed only in the presence of CL-containing liposomes (by ~13.7% at 25℃, ~19.4% at 37℃ and ~21.4% at 45℃), but is absent both in the presence of PC and PA. The intensity of chemiluminescence increases by 26% when the temperature rises from 25 to 37℃ in the presence of PA. During the transition from 37 to 45℃, no increase in the intensity of Cyt C chemiluminescence in the presence of phospholipids was detected. It is particularly interesting that both spectrofluorimetry methods and the evaluation of cytochrome c- induced POL (chemiluminescence with coumarin) have shown the phenomenon of hysteresis when heating CytC complexes with anionic phospholipids. This phenomenon was manifested in the fact that the structural and functional properties of cytochrome c when it was heated to 45C and then cooled to 25C significantly differed (up to about 26%) from similar samples that were not preheated, but simply measured at 25C.

Thus, it is shown that: 1. An increase in temperature changes the conformation and peroxidase activity of CytC; 2. Peroxidase activity increases in the presence of anionic phospholipids; 3. Temperature incubation of CytC with PA and CL has led to irreversible conformational changes, unlike the control PC, which can explain the molecular mechanisms of the hysteresis effect, which is delayed during hyperthermia even recommendations according to tht application.



References

1. Datta NR, et al. Local hyperthermia combined with radiotherapy and-/or chemotherapy: recent advances and promises for the future. Cancer Treat Rev. 2015.