Микровязкость мембран играет важную роль в клеточной биофизике, контролируя скорость диффузии и транспорта, активность многих ферментов и рецепторов. Изменение значения микровязкости и/или липидного состава в живой клетке может сигнализировать о серьёзных нарушениях, в том числе превращении нормальной клетки в раковую. Понимание роли микровязкости мембраны в ответе опухолевых клеток на химиотерапию важно, так как клеточная мембрана активно участвует в транспорте лекарственных средств. Недавние исследования позволяют предположить, что ответ опухоли на химиотерапию определяется не только взаимодействием препарата с первичной мишенью (например, ДНК), но может включать в себя множественные физиологические и физико-химические изменения. Особый интерес представляет изучение свойств цитоплазматических мембран опухолевых клеток и изменений, которые развиваются при проведении противоопухолевой терапии. Изучение влияния химиотерапевтических препаратов на вязкость живых клеток важно для лучшего понимания механизмов действия препаратов и оценки эффективности терапии.

Настоящая работа направлена на изучение микровязкости плазматической мембраны раковых клеток с использованием флуоресцентного молекулярного ротора BODIPY 2 и флуоресцентной микроскопии времени жизни FLIM при химиотерапии препаратами платины.

Исследование проведено на культивируемых раковых клетках СТ26 (колоректальный рак мыши), НСТ116 (колоректальный рак человека) и устойчивой к оксалиплатину клеточной линии - НСТ116-OXAR. Исследования на животных проводили на мышах линий Balb/c и nu/nu с подкожно трансплантированными опухолями. Время жизни флуоресценции молекулярного ротора регистрировали с помощью конфокального микроскопа LSM 880 (Carl Zeiss, Германия), оснащенного модулем FLIM на основе TCSPC (Becker&Hickl Inc., Германия). Микровязкость измеряли в плазматических мембранах отдельных клеток с использованием флуоресцентного молекулярного ротора BODIPY2 (возб. 850 нм, рег. 500–550 нм). На клетки воздействовали цисплатином (Teva, Израиль) в дозе 2,6 мкМ (IC50) для СТ26 и оксалиплатином (Teva, Израиль) в дозе 4,0 мкМ (IC50) для НСТ116. Для исследования химического состава липидов использовали времяпролетную масс-спектрометрию вторичных ионов на приборе ToF-SIMS 5 (ION-TOF Gmbh, Германия). Для каждого образца было получено 12 масс-спектров в режиме как положительных и отрицательных ионов. Выход вторичных ионов липидов рассчитывали как интенсивность соответствующего липидного пика, нормированную на общее количество ионов.

Были разработаны методики оценки микровязкости мембран живых опухолевых клеток для моделей с различной организацией: монослойных клеточных культур, сфероидов и подкожных опухолей мышей. Впервые нами было продемонстрировано, что микровязкость мембран можно измерить в подкожных опухолях in vivo с субклеточным разрешением, используя FLIM с чувствительным к вязкости водорастворимым молекулярным ротором BODIPY2.

В ходе работы зарегистрировано значительное увеличение микровязкости мембран жизнеспособных клеток СТ26 через 24 ч после инкубации с цисплатином с 322 ± 21 сП до 400 ± 27 сП. Инкубация клеток HCT116 с оксалиплатином так же приводила к повышению микровязкости мембран с 437 ± 77 сП до 593 ± 139 сП после 24 ч инкубации с химиопрепаратом. Данные хорошо согласуются между собой на разных моделях, дозозависимого эффекта не выявлено. С помощью метода масс-спектрометрии ToF-SIMS обнаружено увеличение количества холестерина и снижением содержания ненасыщенных жирных кислот в мембранах через 24 ч.

Для проверки полученных эффектов на вязкость мембраны был проведен анализ изменения микровязкости в химиорезистентных клетках HCT116-OXAR под действием оксалиплатина. Инкубация с оксалиплатином не повлияла на микровязкость мембран, значения составили ~450 сП. Мы предполагаем, что зарегистрированное повышение микровязкости мембран на поздних сроках инкубации с платиносодержащими препаратами (24 ч) является частью ответа опухолевой клетки на воздействие и не связано с непосредственным взаимодействием препарата с мембраной.

Проведенное исследование расширяет понимание механизмов ответа опухоли на лечение и действия химиопрепаратов, что важно для поиска новых противоопухолевых мишеней и способов мониторинга эффективности терапии. Полученные данные могут быть полезны при разработке новых видов противоопухолевого лечения и усовершенствования уже существующих. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда в рамках гранта № 23-74-00045.

Membrane microviscosity plays an important role in cell biophysics, controlling the rate of diffusion and transport, and the activity of many enzymes and receptors. A change in the value of microviscosity and/or lipid composition in a living cell can signal serious disorders, including the transformation of a normal cell into a cancer cell. Understanding the role of membrane microviscosity in the response of tumor cells to chemotherapy is important, since the cell membrane is actively involved in drug transport. Recent studies suggest that the response of a tumor to chemotherapy is determined not only by the interaction of the drug with the primary target (eg, DNA), but may include multiple physiological and physicochemical changes. Of particular interest is the study of the properties of the cytoplasmic membranes of tumor cells and the changes that develop during antitumor therapy. The study of the effect of chemotherapeutic drugs on the viscosity of living cells is important for a better understanding of the mechanisms of drug action and evaluation of the effectiveness of therapy.

This work is aimed to study the microviscosity of the plasma membrane of cancer cells using a fluorescent molecular rotor BODIPY2 and fluorescent lifetime imaging microscopy FLIM during chemotherapy with platinum drugs.

The study was carried out on cultured cancer cells CT26 (mouse colorectal cancer), HCT116 (human colorectal cancer) and oxaliplatin-resistant cell line - HCT116-OXAR. Animal studies were performed on Balb/c and nu/nu mice with subcutaneously transplanted tumors. The molecular rotor fluorescence lifetime was recorded using an LSM 880 confocal microscope (Carl Zeiss, Germany) equipped with a TCSPC-based FLIM module (Becker&Hickl Inc., Germany). Microviscosity was measured in the plasma membranes of individual cells using a BODIPY2 fluorescent molecular rotor (excitation 850 nm, reg. 500–550 nm). Cells were treated with cisplatin (Teva, Israel) at a dose of 2.6 μM (IC50) for CT26 and oxaliplatin (Teva, Israel) at a dose of 4.0 μM (IC50) for HCT116. To study the chemical composition of lipids, time-of-flight mass spectrometry of secondary ions was used on a ToF-SIMS 5 instrument (ION-TOF Gmbh, Germany). For each sample, 12 mass spectra were obtained in the mode of both positive and negative ions. The yield of secondary lipid ions was calculated as the intensity of the corresponding lipid peak, normalized to the total number of ions.

Protocols for imaging the microviscosity of membranes of living tumor cells were developed for models with different organization: monolayer cell cultures, spheroids, and subcutaneous tumors in mice. We have demonstrated for the first time that membrane microviscosity can be measured in subcutaneous tumors in vivo with subcellular resolution using FLIM with a viscosity-sensitive water-soluble molecular rotor BODIPY2.

During the work, a significant increase in the microviscosity of membranes of viable CT26 cells was recorded 24 h after incubation with cisplatin from 322 ± 21 cP to 400 ± 27 cP. Incubation of HCT116 cells with oxaliplatin also led to an increase in membrane microviscosity from 437 ± 77 cP to 593 ± 139 cP after 24 h of incubation with the chemotherapy drug. The data are in good agreement with each other in different models, no dose-dependent effect was found. Using the ToF-SIMS mass spectrometry method, an increase in the amount of cholesterol and a decrease in the content of unsaturated fatty acids in the membranes were detected after 24 hours.

To test the obtained effects on the membrane viscosity, we analyzed the change in microviscosity in chemoresistant HCT116-OXAR cells under the action of oxaliplatin. Incubation with oxaliplatin did not affect the membrane microviscosity, the values were ~450 cP. We assume that the recorded increase in membrane microviscosity at the late stages of incubation with platinum-containing drugs (24 h) is part of the response of the tumor cell to exposure and is not associated with the direct interaction of the drug with the membrane.

The perfomed study expands the understanding of the mechanisms of tumor response to treatment and the actions of chemotherapy drugs, which is important for the search for new antitumor targets and methods for monitoring the effectiveness of therapy. The data obtained can be useful in the development of new types of anticancer treatment and improvement of existing ones. This work was supported by the Russian Science Foundation, grant no. 23-74-00045.