Растущее население мира требует большего количества продовольствия и современных промышленных и научных прорывов. Развитие области изучения наноструктур позволяет исследовать не только естественные наночастицы, но и создавать искусственные. Применение наночастиц в различных областях, например, биологии и медицине, находится в начальной стадии исследований, и ведется множество in vivo исследований.

Углеродные наночастицы классифицируются как особый тип недавно разработанных квазисферических углеродсодержащих наноматериалов с размерами ниже порядка 10нм. Однако взаимодействие углеродных наночастиц с живыми клетками может привести к неблагоприятным последствиям, например, таким как окислительный стресс. Тем самым, становятся актуальными исследования на живых клетках in vivo и in vitro. Важную роль в такого рода исследованиях отводится экспериментам in vitro на модельных системах на основе клеточных препаратов. Для таких модельных препаратов обоснованным является использование макрофагов – фагоцитирующих клеток способных к быстрому функциональному ответу на различные рода воздействия.

В связи с выше изложенным, целью настоящей работы было: изучение цитотоксического действия углеродных наночастиц на клеточных препаратах на основе перетонеальных мышиных макрофагов.

Объектом исследовании являются перитонеальные макрофаги беспородных белых мышей самцов (далее – «макрофаги» или «клетки»). Макрофаги были выделены стандартным методом цервикальной дислокации и введением в брюшную полость на полторы минуты раствора Хэнкса в объеме 1,2 мл, содержащего 10 моль/л HEPES (pH 7.2). Далее, извлекалась перитонеальная жидкость, обогащенная макрофагами. После этого жидкость с макрофагами по 30 мкл наносилась на покровные стекла, где макрофаги прикреплялись к поверхности покровного стекла путём 45-минутной инкубации во влажной камере при температуре 20°С. После инкубации покровные стекла промывались каплей раствора Хэнкса для удаления не прикрепленных клеток, и помещались в малые чашки Петри (2 мл). После чего в чашки Петри, в которые были помещены стекла, добавлялся раствор Хэнкса с HEPES в объеме 2мл. В данном растворе клетки находились в течение проведения всего эксперимента.

Исследования проведены с помощью микрофлуориметрического анализа одиночных клеток с использованием метода перекрестной окраски флуоресцентными зондами: флуоресцеиндиацетатом (ФДА) и бромидом этидия (БЭ) в конечной концентрации 5мкг/мл. Время инкубации клеточных препаратов составляло 15 минут в темных условиях после чего клетки отмывались от не связавшихся красителей и производился подсчет клеток с поврежденной мембраной. Клетки с зеленой флуоресценцией считались целыми, а с ярко оранжевой или красной с поврежденной мембраной т.к. при повреждении мембраны флуоресцеин вытекал из клетки, а БЭ проникал через, образовавшиеся в мембране дефекты и связывался с ДНК и РНК клеток.

Для анализа обнаружения клеток с поврежденной плазматической мембраной использовался люминесцентный микроскоп "ЛЮМАМ И3", оснащенный галогеновой лампой для возбуждения флуоресценции препаратов и набором светофильтров.

Инкубация перитонеальных макрофагов с углеродными наночастицами проводилась в временном до 210 мин и концентрационном интервалах от 0,0009 до 0,0225мкг/мл при 20°С. В результате экспериментов выявлено, что значительное статистически достоверное повреждение начинается с 90 минуты инкубации при всех перечисленных концентрациях. Достигая максимального повреждающего эффекта к 210 минуте. Увеличение концентрации наночастиц в исследуемом диапазоне концентраций не приводило значительному эффекту увеличения повреждения.

Повреждающее действие углеродных наночастиц на плазматические мембраны макрофагов в тех же концентрациях при температуре 37°С и во временном интервале до 60-ти минут показала, что уже на 15-ой минуте инкубации клеток с наночастицами происходит резкое возрастание содержания клеток с поврежденной мембраной. При этом повышение концентраций приводит к более выраженному эффекту повреждения на 15-й минуте инкубации и отсутствию такой выраженности в более поздние сроки инкубации. Эффект повреждения плазматических мембран перитонеальных макрофагов обсуждается сточки зрения увеличения генерации активных форм кислорода (АФК) и как следствие повреждения липидного бислоя плазматической мембраны за счет интенсификации процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Таким образом, настоящее исследование показавает, что углеродные наночастицы оказывают цитотоксическое действие на перитонеальные мышиные макрофаги, вызывая повреждение плазматических мембран клеток. Было установлено, что повреждение плазматических мембран зависит как от времени, так и от концентрации наночастиц, причем значительное повреждение происходит при всех концентрациях после 90 минут инкубации при температуре инкубации - 37°С. Увеличение же концентрации наночастиц не привело к значительному увеличению повреждений, по крайней мере в интервале, исследуемых концентраций. Исследование также предполагает, что повреждающее действие углеродных наночастиц на плазматические мембраны макрофагов может быть связано с увеличением генерации реактивных форм кислорода и усилением перекисного окисления липидов. В целом, эти результаты дают важное представление о потенциальном токсическом воздействии углеродных наночастиц на клетки и подчеркивают необходимость дальнейшего изучения их биологических эффектов

The growing population of the world requires more food and modern industrial and scientific breakthroughs. The development of the field of studying nanostructures makes it possible to study not only natural nanoparticles, but also to create artificial ones. The application of nanoparticles in various fields, for example, biology and medicine, is in the initial stage of research, and many in vivo studies are being conducted.

Carbon nanoparticles are classified as a special type of newly developed quasi-spherical carbon-containing nanomaterials with sizes below the order of 10nm. However, the interaction of carbon nanoparticles with living cells can lead to adverse consequences, for example, such as oxidative stress. Thus, studies on living cells in vivo and in vitro become relevant. An important role in this kind of research is given to in vitro experiments on model systems based on cellular preparations. For such model preparations, it is reasonable to use macrophages – phagocytic cells capable of rapid functional response to various types of exposure.

In connection with the above, the purpose of this work was: to study the cytotoxic effect of carbon nanoparticles on cellular preparations based on peretoneal mouse macrophages.

The object of the study is the peritoneal macrophages of mongrel white male mice (hereinafter referred to as "macrophages" or "cells"). Macrophages were isolated by the standard method of cervical dislocation and injection of a 1.2 ml Hanks solution containing 10 mol/l HEPES (pH 7.2) into the abdominal cavity for one and a half minutes. Next, peritoneal fluid enriched with macrophages was extracted. After that, a liquid with macrophages of 30 µl was applied to the cover glasses, where macrophages were attached to the surface of the cover glass by 45-minute incubation in a moist chamber at a temperature of 20 ° C. After incubation, the cover glasses were washed with a drop of Hanks solution to remove non-attached cells, and placed in small Petri dishes (2 ml). After that, a 2ml Hanks solution with HEPES was added to the Petri dishes in which the glasses were placed. The cells were in this solution during the entire experiment.

The studies were carried out using microfluorimetric analysis of single cells using the method of cross-staining with fluorescent probes: fluoresceindiacetate (FDA) and ethidium bromide (BE) at a final concentration of 5mcg/ml. The incubation time of the cell preparations was 15 minutes in dark conditions, after which the cells were washed from the non-binding dyes and cells with a damaged membrane were counted. Cells with green fluorescence were considered whole, and those with bright orange or red with a damaged membrane because when the membrane was damaged, fluorescein flowed out of the cell, and BE penetrated through the defects formed in the membrane and bound to the DNA and RNA of the cells.

To analyze the detection of cells with a damaged plasma membrane, a luminescent microscope "LUMAM I3" was used, equipped with a halogen lamp to excite the fluorescence of drugs and a set of light filters.

Incubation of peritoneal macrophages with carbon nanoparticles was carried out in time up to 210 min and concentration intervals from 0.0009 to 0.0225 micrograms/ml at 20°C. As a result of experiments, it was revealed that significant statistically significant damage begins with 90 minutes of incubation at all these concentrations. Achieving maximum damaging effect by 210 minutes. An increase in the concentration of nanoparticles in the studied concentration range did not lead to a significant effect of increased damage.

The damaging effect of carbon nanoparticles on the plasma membranes of macrophages in the same concentrations at a temperature of 37°C and in a time interval of up to 60 minutes showed that already at the 15th minute of incubation of cells with nanoparticles there is a sharp increase in the content of cells with a damaged membrane. At the same time, an increase in concentrations leads to a more pronounced damage effect at the 15th minute of incubation and the absence of such severity at a later incubation period. The effect of damage to the plasma membranes of peritoneal macrophages is discussed from the point of view of increasing the generation of reactive oxygen species (ROS) and as a consequence of damage to the lipid bilayer of the plasma membrane due to the intensification of the process of lipid peroxidation (LPO).

Thus, the present study shows that carbon nanoparticles have a cytotoxic effect on peritoneal mouse macrophages, causing damage to the plasma membranes of cells. It was found that damage to plasma membranes depends on both the time and the concentration of nanoparticles, and significant damage occurs at all concentrations after 90 minutes of incubation at an incubation temperature of 37°C. An increase in the concentration of nanoparticles did not lead to a significant increase in damage, at least in the range of concentrations studied. The study also suggests that the damaging effect of carbon nanoparticles on the plasma membranes of macrophages may be associated with an increase in the generation of reactive oxygen species and increased lipid peroxidation. Overall, these results provide an important insight into the potential toxic effects of carbon nanoparticles on cells and highlight the need for further study of their biological effects.