Регистрация сигналов вариабельной флуоресценции хлорофилла – важный неинвазивный метод изучения фотосинтетических реакций в живых растениях. В настоящее время в серьезной лабораторной экспериментальной работе с фотосинтезирующими организмами (высшими растениями, одно- и много клеточными водорослями, лишайниками и цианобактериями) используют флуориметры с наиболее широким функционалом, т.н. PAM-флуориметры немецкой фирмы Walz, где исследователь, за счет использования нескольких независимых источников света, может оказывать различного рода контролируемые воздействия на электронный транспорт между фотосистемой 2 и фотосистемой 1. Наиболее характерным признаком прибора PAM является наличие модулированного в диапазоне нескольких килогерц слабого измерительного света (десятые и сотые доли мкмоль∙м-2∙с-1). С одной стороны, такой пучок света гарантирует пренебрежимо малое собственное влияние на фотосинтетический электронный транспорт, на процессы регуляции фотосинтеза и на квантовый выход (интенсивность) флуоресценции хлорофилла. Но с другой стороны, низкая интенсивность измеряющего пучка существенно ограничивает область применения прибора, когда речь заходит о необходимости измерений флуоресценции в природных условиях – например в открытой для прямых солнечных лучей измерительной камере или при низком содержании хлорофилла, характерного для естественных водоемов.

В докладе представлен комплекс флуориметров, созданных на кафедре биофизики и построенных на несколько иной технологии управления источником возбуждения флуоресценции – на т.н. принципе «fast-repetition-rate». При помощи единственного мощного источника света он позволяет измерить кривые индукции и релаксации флуоресценции с высоким отношением сигнал/шум даже в присутствии интенсивного и зашумленного фона естественной облученности и определить фотохимический квантовый выход ФС2 (отношение Fv/Fm). FRR-флуориметры также могут провести предварительную адаптацию объекта к актиничному облучению и измерить световые кривые нефотохимического тушения (NPQ) и относительной скорости электронного транспорта (ETR), характеристики которых в большой степени зависят от температуры, от видовой принадлежности растения или видового состава фитопланктона и от условий их длительного предварительного содержания.

Удобство пользования приборами и точность измерений флуоресценции в природных условиях также существенно увеличены за счет специализированного программного обеспечения, созданного на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ.

Комплекс приборов включает в себя:

• портативный флуориметр "Smart 8" c затемненной измерительной камерой и кюветой под образец воды на 50мл c возможностью термостатирования и дополнительной регистрацией кривой индукции замедленной флуоресценции на пробах фитопланктона;

• портативный прибор "Smart 4" без кюветного отделения для регистрации сигналов от объектов, находящихся в условиях естественной облученности, и от суспензий микроводорослей в прозрачных колбах или фотобиореакторах;

• портативный прибор "Tubby FRR" с 4мл флаконом для фитопланктона и культур водорослей с содержанием хлорофилла не менее 5мкг/л и для количественного определения содержания хлорофилла «а» в ацетоновом экстракте;

• лазерный флуориметр во всепогодном исполнении с длинноволновым возбуждением (650нм) для круглогодичной регистрации флуоресценции на молодых побегах (ветвях) древесных растений;

• микроскоп с FRR протоколом возбуждения флуоресценции от отдельных клеток фитопланктона.

Особенности каждого прибора представлены на примерах исследовательской работы in situ с образцами морской воды, с лишайниками и листьями при круглосуточных наблюдениях на улице, а также с одноклеточными водорослями в процессе культивирования и в экспериментах по биотестированию.

Variable chlorophyll fluorescence detection is an important non-invasive method for studying photosynthetic reactions in living organisms. Today, serious laboratory experimental work with photosynthetic organisms (plants, unicellular and multicellular algae, lichens and cyanobacteria) relies on fluorimeters with the widest functionality known as PAM-fluorometers (Walz company, Germany) where the researcher by means of several independent light sources can exert various kinds of treatment on the electron transfer between photosystem 2 and photosystem 1. The most famous feature of the PAM device is the presence of weak measuring light modulated in the range of several kilohertz (tenths and hundredths of µmol∙m-2∙s-1). On the one hand, such a beam guarantees a negligible intrinsic effect on photosynthetic electron transport, on the processes of photosynthesis regulation, and on the quantum yield (intensity) of chlorophyll fluorescence. But on the other hand, the low intensity of the measuring beam significantly limits the performance of the device when it comes to measure fluorescence in natural conditions - in a measuring chamber open to direct sunlight or at low chlorophyll content typical for natural waters.

The report presents a complex of fluorometric devices designed at the Department of Biophysics and built on a slightly different technology for controlling a fluorescence excitation source known as "fast-repetition-rate" (FRR). Using a single powerful light source, the FRR protocol allows to measure the fluorescence induction and relaxation curves at a high signal-to-noise ratio even in the presence of an intense and noisy background natural irradiance and to determine the photochemical quantum yield of PS2 (Fv/Fm ratio). FRR fluorometers can also pre-adapt an object to actinic light and measure light slopes of non-photochemical quenching (NPQ) and relative electron transport rate (rETR) whose characteristics depend highly on temperature, on the plant spesies or phytoplankton taxonomic composition, and other conditions. The ease of use of the instruments as well as fluorescence measurements accuracy in natural conditions are also significantly increased due to specialized software developed at the Department of Biophysics.

The set of devices includes:

• A portable fluorometer «Smart 8» with a darkened measuring chamber and a 50 ml cuvette for water samples with the temperature control and additional registration of the delayed fluorescence induction curve on phytoplankton samples;

• A portable device «Smart 4» which has no measuring chamber - for fluorescence signals recording from objects under natural irradiation and from microalgae suspensions in transparent flasks or photobioreactors;

• «Tubby FRR» portable device with 4 ml vial for reach phytoplankton samples and algae cultures (chlorophyll contents 5 µg/l of higher) and for quantification of chlorophyll a content in acetone extracts;

• All-weather laser fluorometer with long-wavelength excitation (650nm) for year-round registration of fluorescence on young shoots (branches) of woody plants;

• A microscope with FRR excitation protocol to measure fluorescence transients arising from individual phytoplankton cells.

The features of each instrument are demonstrated in examples of in situ research performed on seawater samples, lichens and leaves during outdoor observations, as well as on microalgae used in bioassay experiments and photobioreactors.