Модель генетической адаптации в пределах фитопатогенного рода Xanthomonas (гамма-протеобактерии) была предложена для белка конденсации льда (Ice nucleation protein - Inp). Образование льда инициируется частицами Inp из-за их специфических свойств поверхности, которые снижают энергетический барьер для кристаллообразования льда (Szyrmer, Zawadzki, 1997). Бактерии, выделяющие Inp, вызывают быстрое образование ледяных кристаллов при температурах до -2 °C (Morris et al., 2004). Центральный домен Inp (1034-1567 аминокислот) состоит из тандемных повторов длиной 8, 16(17) или 48 аминокислотных остатков. ЯМР-анализ синтетических пептидов, соответствующих повторяющимся доменам у Xanthomonas campestris показал, что пептид с 17 остатками образует петлевую структуру активного центра Inp (Kumaki et al. 2008). Количество повторов было пропорционально активной поверхности конденсации льда Inp. Была показана взаимосвязь между размером теоретической молекулярной массы структур, инициирующих образование ледяных кристаллов, и средней температурой замерзания (Ling et al. 2018). В данной работе, мы оценили два фактора: молекулярную массу 16-аминокислотных тандемных повторов Inp (Inp16R) и среднее количество мономерных субъединиц Inp16R для 368 геномов Xanthomonas, доступных в NCBI GenBank. Среднее, минимальное, максимальное количество и стандартное отклонение Inp16Rs были рассчитаны в сравнении с таксономическим положением бактерий и территорией (климатической зоной) встречаемости патогенов. Были проанализированы штаммы 15 видов Xanthomonas и 15 штаммов без определенной таксономической привязки. В результате исследования была установлена достоверная отрицательная корреляция между средними температурами в зоне распространения патогена и количеством Inp16Rs. Например, субтропический патоген рис, X. oryzae, имел всего 12 Inp16Rs, в то время как патогены, такие как X. campestris, X. hortorum, распространенные в зоне умеренного климата, имели от 48 до 84 повторов. Вид с самым широким распространением, X. arboricola, возбудитель болезней многих культурных деревьев и насаждений (Игнатов и др., 2015), имел самый широкий диапазон числа повторов: от 3 до 74.

Когда количество Inp16R было экспериментально уменьшено (Ling et al., 2018), укороченная версия Inp сохранила некоторую активность образования ледяных кристаллов, несмотря на более чем четырехкратное уменьшение теоретической поверхности связывания со льдом по сравнению с интактной версией белка. Поэтому, можно уверенно полагать, что все штаммы, имеющие Inp сохраняют способность к конденсации льда. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в популяции Xanthomonas существует генетическая адаптация размера активных поверхностей белка конденсации льда, пропорциональная температурам в зонах распространения патогенов.



Благодарности: Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 23-26-00168



Литература



1. Ignatov AN, Kyrova EI, Vinogradova SV, Kamionskaya AM, Schaad NW, Luster DG. Draft genome sequence of Xanthomonas arboricola strain 3004, a causal agent of bacterial disease on barley. Genome announcements. 2015 Feb 26;3(1):e01572-14.

2. Kumaki Y., Kawano K., Hikichi K., et al. A circular loop of the 16-residue repeating unit in ice nucleation protein. Bioch Bioph Res Comm 2008; 371, 5-9

3. Ling M. L., Wex H., Grawe S., et al.. Effects of ice nucleation protein repeat number and oligomerization level on ice nucleation activity. J Geophys Res: Atmosph 2018; 123, 1802–1810. https://doi.org/10.1002/2017JD027307

4. Morris C. E., Georgakopoulos D. G., Sands, D. C. Ice nucleation active bacteria and their potential role in precipitation. Journal de Physique IV - Proceedings, 2004; 121, 87–103. https://doi.org/10.1051/jp4:2004121004

5. Szyrmer W., Zawadzki I. Biogenic and anthropogenic sources of ice-forming nuclei: A review. Bull Am Meteorolog Soc 1997; 78(2), 209–228. https://doi.org/10.1175/1520-04772

The model of genetic adaptation within phytopathogenic genus Xanthomonas (gamma-proteobacteria) was evaluated for ice nucleation protein (Inp). Ice formation is triggered by the Inp particles due to their specific surface properties, which reduce the energy barrier for freezing (Szyrmer & Zawadzki, 1997). Inp triggers ice formation at temperatures as high as -2°C (Morris et al., 2004). The central domain of Inp (1034–1567 aa) consists of tandem repeats with the 8, 16(17), or 48-aa sequences. NMR measurements were made for synthetic peptides corresponding to a section of the repetitive domains in Xanthomonas campestris Inp. Structure calculation reveals that the 17-residue peptide forms a circular loop (Kumaki et al. 2008). The relationship between the ice nuclei size of the Inp (the theoretical molecular weight of ice-binding sites) and the median freezing temperature was estimated as direct and positively correlated (Ling et al. 2018). The number of repeats was proportional to the ice active surface of Inp. We evaluated two factors: the molecular weight of 16 amino acid tandem repeats of Inp (Inp 16R) and the average number of monomeric subunits Inp 16R for 368 Xanthomonas genomes available in NCBI GenBank. Average, minimal, maximal number, and standard deviation of Inp 16Rs were calculated for comparison to taxonomic position of bacteria and inhabited area (climate zone). Strains of 15 Xanthomonas species and 15 strains without certain taxonomic assessment were analysed. As result of this study, we established a well-defined negative correlation between average temperatures in the pathogen distribution area and the number of Inp 16Rs. For example, subtropical pathogen or rice, X. oryzae, had only 12 16Rs, when pathogens, such as X. campestris, X. euroxanthea, X. hortorum, spread in temperate climate zone had from 48 to 84 repeats. The species of widest distribution, X. arboricola, pathogen of many cultivated trees and crop plants (Ignatov et al. 2015) had the broadest range of repeats number: from 3 to 74.

When the number of Inp 16R was reduced in a model experiment (Ling et al. 2018), the truncated version of the Inps retained a decreased ice nucleation activity, despite a more than fourfold reduction of the theoretical ice-binding surface compared to the intact version of the protein. Therefore, it can be assumed that all strains having Inp retain the ability to ice nucleation. Obtained results suggested that Xanthomonas population have genetic adaptation of size of the ice active surfaces proportional to temperatures across the pathogens distribution zones.



Acknowledgments: The work was supported by Russian Science Foundation grant № 23-26-00168



References

1. Ignatov AN, Kyrova EI, Vinogradova SV, Kamionskaya AM, Schaad NW, Luster DG. Draft genome sequence of Xanthomonas arboricola strain 3004, a causal agent of bacterial disease on barley. Genome announcements. 2015 Feb 26;3(1):e01572-14.

2. Kumaki Y., Kawano K., Hikichi K., et al. A circular loop of the 16-residue repeating unit in ice nucleation protein. Bioch Bioph Res Comm 2008; 371, 5-9

3. Ling M. L., Wex H., Grawe S., et al.. Effects of ice nucleation protein repeat number and oligomerization level on ice nucleation activity. J Geophys Res: Atmosph 2018; 123, 1802–1810. https://doi.org/10.1002/2017JD027307

4. Morris C. E., Georgakopoulos D. G., Sands, D. C. Ice nucleation active bacteria and their potential role in precipitation. Journal de Physique IV - Proceedings, 2004; 121, 87–103. https://doi.org/10.1051/jp4:2004121004

5. Szyrmer W., Zawadzki I. Biogenic and anthropogenic sources of ice-forming nuclei: A review. Bull Am Meteorolog Soc 1997; 78(2), 209–228. https://doi.org/10.1175/1520-0477