Исследовано влияние гербицида раундапа (Рп) или глифосата (Гл) на пероксидазу хрена (ПО). Рп является самым распространённым препаратом по объёму производства и применения в практике сельского хозяйства в мире. Однако Рп оказывает токсическое действие на живые организмы всех трофических уровней; у людей вызывает множество патологий: нарушения в работе печени, почек, онкологические заболевания. В марте 2015 г. Международное агенство по изучению рака ВОЗ, обнародовало заключение, о том, что Гл является «возможным канцерогеном для человека» (категория опасности «2А»). В заключении приводятся данные о повышенном уровне развития неходжкинской лимфомы у работающих с Гл [1]; о развитии рака у лабораторных крыс и мышей [2,3]; о способности Гл повреждать ДНК и вызывать аберрации хромосом в клетках человека и животных, культивируемых in vitro; а также приводить к повышению частоты хромосомных повреждений (микроядер) в клетках крови [3].

Считается, что Рп ингибирует 5-еноилпирувил-шикимат-3-фосфат-синтазу (КФ 2.5.1.19) [4]. Однако ранее было показано, что Рп ингибирует активность фермента НАДН-оксидоредуктазы, катализирующего многие окислительно-восстановительные (ред-окс) реакции [5]. Естественно вставал вопрос о способности ред-окс системы организма растения или животного окислять и обезвреживать данное химическое токсичное соединение. Способность объектов окружающей среды к самоочищению, т.е. разложению загрязняющих веществ, во многом определяется протеканием ферментативных ред-окс процессов в клетках растений и микроорганизмов. Поэтому мы исследовали действие Рп именно на окислительный фермент.

Выбор фермента обусловлен тем, что пероксидазы (КФ 1.11.1.Х) относятся к ферментам основной антиоксидантной системы, разрушающей пероксид водорода и окисляющие широкий спектр субстратов. Обычно пероксидазы функционируют в присутствии пероксида водорода.

Гербицид Рп (или Гл) имеет множество коммерческих названий, но в качестве действующего вещества – это химическое соединение N-(фосфонометил)-глицин, C3H8NO5P (N-ФМГ). В связи с этим, мы проводили работы с действующим веществом N-ФМГ, который выделяли из коммерческого препарата Рп двойной перекристаллизацией из воды.

В качестве субстрата был выбран гидрохинон (ГХ), который относится к группе быстро окисляемых субстратов ПО. В работе изучена кинетика окисления ГХ пероксидазой хрена в присутствии Рп. Окисление ГХ регистрировали на спектрофотометре PerkinElmer UV-VIS Spectrometer «Lambda EZ 210», производства США по уменьшению поглощения при длине волны λ = 290 нм. Условия проведения экспериментов: ГХ (0,05–0,4·10-3 М), Н2О2 (0,64·10-3 М), пероксидаза хрена (15·10-9 М), 0,05 М Na-ацетатный буфер, рН 5,4, T = 250C.

В предварительном исследовании установлена устойчивость как ГХ, так и Рп в условиях проведения экспериментов и отсутствие взаимодействия между ними.

В ходе иcследования определены следующие кинетические параметры ПО в реакции окисления ГХ: константа Михаэлиса Km (по ГХ) для системы I (ГХ + Н2О2 + ПО) и для системы II в присутствии Рп (ГХ + Н2О2 + ПО + Рп) составляет 0,168 мкМ; Vmax для системы I составляет 4,31 мкМ/с и в присутствии Рп для системы II 3,44 мкМ/с.

Тип ингибирования и константу ингибирования определяли в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка. Показано, что Рп проявляет неконкурентный тип ингибирования по отношению к окисляющему ферменту ПО.

Впервые показано, что N-ФМГ ингибирует ферментативной активности пероксидазу из корней хрена. Данный результат является серьёзным дополнением к имеющимся литературным данным о мишенях, на которые направлено действие раундапа.

Полученные результаты доказывают, что N-ФМГ блокирует работу антиоксидантной системы, что в теплокровных организмах может явиться причиной накопления свободных радикалов, и онкологических перерождений тканей и органов.



Работа выполнена в соответствии с государственным заданием № 0089-2019-0014 (№ государственной регистрации АААА-А19-119071890015-6).



1. Guyton K.Z., Loomis D., Grosse Ya., et all. Carcinogenicity of tetrachlorvinphos, parathion, malathion, diazinon, and glyphosate // The Lancet, 2015. V. 16, no. 5. P. 490-491. doi:10.1016/S1470-2045(15)70134-8

2. Cressey D. Widely used herbicide linked to cancer // Nature. 2015. doi:10.1038/nature.2015.17181

3. IARC Monographs Volume 112: evaluation of five organophosphate insecticides and herbicides. International Agency for Research on Cancer, World Health Organization (20 March 2015).

4. Кузнецова Е.М., Чмиль В.Д. Глифисат: поведение в окружающей среде и уровни остатков // Современные проблемы токсикологии. Киев, 2010. № 1. С. 87-95.

5. Саратовских Е.А., Коршунова Л.А., Гвоздев Р.И., Куликов А.В. Ингибирование НАДН-оксидоредуктазной реакции гербицидами и фунгицидами различного строения // Известия АН. Сер. хим. 2005. № 5. С. 1284–1289.

The effect of the herbicide Roundup (Rp) or Glyphosate (Gl) on horseradish peroxidase (HRP) was studied. Rp is the most common drug in terms of production and use in agricultural practice in the world. However, Rp has a toxic effect on living organisms of all trophic levels; causes many pathologies in people: disorders in the functioning of the liver, kidneys, oncological diseases. In March 2015, the WHO International Agency for Research on Cancer published a conclusion that Gl is a “possible human carcinogen” (hazard category “2A”). In conclusion, data are presented on an increased level of development of non-Hodgkin's lymphoma in those working with Gl [1]; on the development of cancer in laboratory rats and mice [2,3]; about the ability of GL to damage DNA and cause chromosome aberrations in human and animal cells cultivated in vitro; and also lead to an increase in the frequency of chromosomal damage (micronuclei) in blood cells [3].

It is believed that Rp inhibits 5-enoylpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase [4]. However, it was previously shown that Rp inhibits the activity of the enzyme NADH oxidoreductase, which catalyzes many redox reactions [5]. Naturally, the question arose about the ability of the red-ox system of a plant or animal organism to oxidize and neutralize this chemical toxic compound. The ability of environmental objects to self-purify, i.e. decomposition of pollutants, is largely determined by the occurrence of enzymatic red-ox processes in the cells of plants and microorganisms. Therefore, we studied the effect of Rp specifically on the oxidative enzyme.

The choice of the enzyme was due to the fact that peroxidases belong to the enzymes of the main antioxidant system that destroys hydrogen peroxide and oxidizes a wide range of substrates. Typically, peroxidases function in the presence of hydrogen peroxide.

The herbicide Rp (or Gl) has many commercial names, but the active ingredient is the chemical compound N-(phosphonomethyl)-glycine (N-PMG). In this regard, we carried out work with the active substance N-PMG, which was isolated from the commercial drug Rp by double recrystallization from water.

Hydroquinone (HC) was chosen as a substrate, which belongs to the group of rapidly oxidized PO substrates. The kinetics of HC oxidation by horseradish peroxidase in the presence of Rp was studied in this work. HC oxidation was recorded on a PerkinElmer UV-VIS Spectrometer "Lambda EZ 210", manufactured in the USA to reduce absorption at a wavelength of λ = 290 nm. Experimental conditions: HC (0.05–0.4 10-3 M), H2O2 (0.64 10-3 M), horseradish peroxidase (15 10-9 M), 0.05 M Na-acetate buffer, pH 5.4, T = 250C.

In a preliminary study, the stability of both HC and Rp under the experimental conditions and the absence of interaction between them was established.

In the course of the study, the following kinetic parameters of PO in the HC oxidation reaction were determined: the Michaelis constant Km (according to HC) for system I (HC + H2O2 + PO) and for system II in the presence of Rp (HC + H2O2 + PO + Rp) is 0.168 μM; Vmax for system I is 4.31 µM/s and in the presence of Rp for system II 3.44 µM/s.

The type of inhibition and the inhibition constant were determined in double reciprocal Lineweaver-Burk coordinates. It has been shown that Rp exhibits a non-competitive type of inhibition with respect to the oxidizing enzyme PO.

It has been shown for the first time that N-PMG inhibits the enzymatic activity of peroxidase from horseradish roots. This result is a serious addition to the available literature data on the targets targeted by the roundup.

The results obtained prove that N-PMG blocks the functioning of the antioxidant system, which in warm-blooded organisms can cause the accumulation of free radicals and oncological degeneration of tissues and organs.



Acknowledgments

This work was carried out in the framework of the state task (state registration no. AAAA-A19- 119071890015-6), theme 0089-2019-0014.



1. Guyton K.Z., Loomis D., Grosse Ya., et all. Carcinogenicity of tetrachlorvinphos, parathion, malathion, diazinon, and glyphosate // The Lancet, 2015. V. 16, No. 5. P. 490-491. doi:10.1016/S1470-2045(15)70134-8

2. Cressey D. Widely used herbicide linked to cancer // Nature. 2015. doi:10.1038/nature.2015.17181

3. IARC Monographs Volume 112: evaluation of five organophosphate insecticides and herbicides. International Agency for Research on Cancer, World Health Organization (20 March 2015).

4. Kuznetsova E.M., Chmil V.D. Glyphisate: environmental behavior and residue levels // Modern problems of toxicology. Kyiv, 2010. No. 1. P. 87-95.

5. Saratovskikh E.A., Korshunova L.A., Gvozdev R.I., Kulikov A.V. Inhibition of the nicotinamide adenine dinucleotide-oxidoreductase reaction by herbicides and fungicides of various structures // Russian Chemical Bulletin, 2005. V. 54, No. 5, P. 1322-1327.