Растения представляют собой неисчерпаемый источник разнообразных биологически активных соединений, в том числе белков и пептидов. Последние как компоненты врожденного иммунитета растений реализуют многообразие функций, направленных на противодействие поражающим факторам внешней среды, в частности, микроорганизмам – возбудителям болезней, а также насекомым-вредителям. Несмотря на то, что за последние три десятилетия был накоплен внушительный объем данных по структурному разнообразию таких молекул, спектру их биологической активности, а также выяснению конкретной роли в растительном иммунитете, крайне мало информации получено в аспекте выяснения механизмов их действия на молекулярном уровне. Наиболее детально исследованы мембрано-активные способы антимикробной активности пептидов растений, как правило, приводящие к клеточному лизису или апоптозу патогенных микроорганизмов. При этом целая группа биологически активных пептидов, проникающих в клетку и осуществляющих свою функцию через ассоциацию с внутриклеточной мишенью, пока остается практически неизученной.

В рамках настоящей работы было исследовано взаимодействие харпино-подобного антимикробного пептида – нигеллина из семян нигеллы посевной (Nigella sativa) с конидиями и мицелием модельного мицеллиального гриба – Aspergillus niger на клеточном и молекулярном уровне. Ранее было показано, что основное антифунгальное действие данной молекулы заключается в задержке физиологического роста и развития грибов, что является приоритетной функцией для многих представителей семейства харпино-подобных защитных пептидов растений (альфа-харпининов). В дальнейшем методом лазерной сканирующей конфокальной флуоресцентной микроскопии установлено, что данный пептид является типичным представителем так называемых «молекул, проникающих в клетку» (cell-penetrating molecules), при этом аналогичный эффект наблюдается в широком диапазоне действующих концентраций (0,5-32 мкМ). По соотношению сигналов зеленого (SYTO GREEN) и красного (йодид пропидия) флуоресцентных красителей выявлено, что при действии исследуемого пептида не приводит к пермеабилизации цитоплазматической мембраны. Данный эффект был зафиксирован во временной динамике (8-24 ч) на фоне наблюдения фунгистатического эффекта по сравнению с контрольным вариантом. С целью понимания вероятной молекулярной детерминанты, ассоциированной с клеточной мембраной и являющейся вероятным «сайтом» первичного связывания пептида, было изучено взаимодействие молекулы с искусственными липидными бислоями методом калориметрического титрования. Для этой цели была использована пара для сравнения – на основе фосфатидилхолина (100%) и фосфатидилхолин/фосфатидилсерина (70/30%), которая обуславливает различия по суммарному заряду мембран. Полученные результаты также говорят о том, что адсорбция нигеллина на более отрицательно заряженных мембранах (фосфатидилхолин/фосфатидилсерин) сильнее, что, по всей видимости, определяет отличия в действии данного пептида на прокариотические и эукариотические клетки.

Работа поддержана проектом Российского научного фонда (№18-74-10073-П).

Plants are a good source of various biologically active compounds, including proteins and peptides. The latter, as components of the innate immunity of plants, implement a variety of functions aimed at counteracting damaging environmental factors, in particular, microorganisms that cause diseases, as well as insect pests. Despite the fact that over the past three decades, an impressive amount of data has been accumulated on the structural diversity of such molecules, the spectrum of their biological activity, and the elucidation of a specific role in plant immunity, very little information has been obtained in terms of elucidating the mechanisms of their action at the molecular level. Membrane-active methods of antimicrobial activity for plant peptides have been studied in most detail, as a rule, leading to cell lysis or apoptosis of pathogenic microorganisms. At the same time, a whole group of biologically active peptides that penetrate the cell and perform their function through association with an intracellular target remains practically unexplored.

In the framework of this work, we studied the interaction of a hairpin-like antimicrobial peptide, nigellin, from Nigella sativa seeds with conidia and mycelium of a model mycelial fungus, Aspergillus niger, at the cellular and molecular level. Previously, it was shown that the main antifungal effect of this molecule is to delay the physiological growth and development of fungi, which is a priority function for many representatives of all hairpin-like plant defense peptides (alpha-hairpinins). Later, using laser scanning confocal fluorescence microscopy, it was found that this peptide is a typical representative of the so-called cell-penetrating molecules, while a similar effect is observed in a wide range of effective concentrations (0.5-32 μM). According to the ratio of the signals of green (SYTO GREEN) and red (propidium iodide) fluorescent dyes, it was revealed that the action of the studied peptide does not lead to permeabilization of the plasma membrane. This effect was recorded in temporal dynamics (8-24 hours) against the background of observing a fungistatic effect compared to the control variant. In order to understand the probable molecular determinant associated with the cell membrane and being the probable “site” of the primary binding of the peptide, the interaction of the molecule with artificial lipid bilayers was studied by calorimetric titration. For this purpose, a comparison pair was used based on phosphatidylcholine (100%) and phosphatidylcholine/phosphatidylserine (70/30%), which causes differences in the total charge of the membranes. The results obtained also indicate that the adsorption of nigellin on more negatively charged membranes (phosphatidylcholine/phosphatidylserine) is stronger, which, apparently, determines the differences in the action of this peptide on prokaryotic and eukaryotic cells.

This work was supported by a project of the Russian Science Foundation (No. 18-74-10073-P).