Влияние 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрина (ГПЦД) и осмолитов (трегалозы, сорбитола, бетаина) на стабильность, кинетику агрегации и олигомерное состояние глутаматдегидрогеназы (ГДГ) из печени быка было изучено методами дифференциальной сканирующей калориметрии, динамического светорассеяния и аналитического ультрацентрифугирования, соответственно. Использовались 2 агрегационные тест-системы: тепловая агрегация ГДГ и агрегация, индуцированная циклом замораживания-оттаивания. Было показано, что все изученные соединения проявляют защитный эффект при агрегации белка. В случае нативной ГДГ термостабильность белка повышается, тогда как при замораживании-оттаивании трегалоза и сорбитол предотвращают полную потерю нативной структуры белка, а ГПЦД и бетаин, кроме того, еще и повышают термостабильность ГДГ, увеличивая температуру денатурации Tmax. Также, по данным аналитического ультрацентрифугирования, все изученные соединения защищают ГДГ от агрегации (а в случае замораживания-оттаивания – от полной преципитации), стабилизируя как нативную гексамерную форму ГДГ с коэффициентом седиментации 14,5 S, так и небольшие олигомеры белка и его диссоциированные формы. Количественная оценка антиагрегационной активности ГПЦД и осмолитов была проведена с помощью анализа кинетики агрегации ГДГ при 50 град. С и агрегации ГДГ, индуцированной замораживанием-оттаиванием, при 25 град. С. Из соотношения начальных скоростей агрегации в присутствии различных концентрациях осмолитов и ГПЦД (v0) и в отсутствие добавок (v0(0)) была рассчитана концентрация полунасыщения [L]0.5 для каждого соединения. В случае тепловой агрегации наиболее высокую антиагрегационную активность продемонстрировала трегалоза ([L]0.5 = 142 мМ). В случае агрегации, индуцированной замораживанием-оттаиванием наибольшим защитным эффектом обладал бетаин: агрегация при 25 град. С после размораживания не наблюдалась при минимальных исследованных концентрациях бетаина (10-50 мМ).

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант №21-14-00178)

The effect of 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HPCD) and osmolytes (trehalose, sorbitol, betaine) on the stability, aggregation kinetics, and oligomeric state of glutamate dehydrogenase (GDH) from bovine liver was studied by differential scanning calorimetry, dynamic light scattering, and analytical ultracentrifugation, respectively. Two aggregation test systems were used: thermal aggregation of GDH and aggregation induced by the freeze-thaw cycle. It was shown that all the studied compounds exhibit a protective effect on the target protein. In the case of native GDH, the thermal stability of the protein increases, while after freeze-thaw cycle, trehalose and sorbitol prevent the complete loss of the native protein structure. Additionally, HPCD and betaine increased the thermal stability of freeze-thawed GDH by increasing the denaturation temperature Tmax. According to analytical ultracentrifugation, all the studied compounds protect GDH from aggregation (and in the case of freeze-thaw cycle, from complete precipitation), stabilizing the native hexameric form of GDH with a sedimentation coefficient of 14.5 S, small oligomers of the target protein and its dissociated forms. Quantification of the antiaggregation activity of HPCD and osmolytes was carried out by analyzing the kinetics of GDH aggregation at 50 deg. C and freeze-thaw-induced aggregation of GDH at 25 deg. C. From the ratio of initial aggregation rates in the presence of various concentrations of osmolytes and HPCD (v0) and in the absence of additives (v0(0)) the half-saturation concentration [L]0.5 for each compound was calculated. In the case of thermal aggregation, trehalose demonstrated the highest antiaggregation activity ([L]0.5 = 142 mM). In the case of freeze-thaw-induced aggregation, betaine had the greatest protective effect: aggregation at 25 deg. C after thawing was not observed even at the lowest concentrations of betaine studied (10-50 mM).

This study was supported by the Russian Science Foundation (grant #21-14-00178)