Введение

Фотодинамическая терапия (ФДТ) оказывает цитотоксическое действие на опухолевые клетки за счет выработки синглетного кислорода. Истощение молекулярного кислорода в опухолевой ткани является ограничивающим фактором для противоопухолевого эффекта ФДТ по всей толщине ткани. Трехмерные опухолевые сфероиды являются хорошей моделью опухолевой ткани с ограниченным поступлением кислорода. Целью данной работы было определить влияние параметров лазерного облучения во время ФДТ на эффективность ингибирования роста опухолевых сфероидов.

Методы

Использовали клеточную линию аденокарциномы толстой кишки мыши CT26. Клетки культивировали в инкубаторе с 5% CO2 в культуральной среде RPMI-1640, дополненной 10 % FBS и пенициллином/стрептомицином. 3D-сфероиды были получены путем посева 1000 клеток в 100 мкл полной среды и культивирования в течение 5 дней в 96-луночных круглодонных планшетах (96-луночный ULA plate, Corning, США). Опухолевые сфероиды диаметром 450-600 мкм инкубировали с фотосенсибилизатором на основе хлорина e6 в концентрации 5 мкг/мл в 200 мкл полной среды. ФДТ проводили 24 часа спустя с использованием лазера с длиной волны 662 нм в режиме непрерывного облучения (CW) и импульсного облучения (Pulse) при скорости потока 50 мВт/см2 с дозой облучения 5, 10, 15, 60 Дж/см2.

Результаты

Было показано, что снижение средней плотности мощности с 50 мВт/см2 до 12,5 мВт/см2 в случае CW ФДТ с дозой облучения 15 Дж/см2 приводит к увеличению повреждения CT26 опухолевых сфероидов в глубину с 50-60 мкм до 160 мкм. Экспериментальное сравнение CW и Pulse режимов ФДТ показало, что максимальная скорость торможения роста опухолевых сфероидов наблюдалась при оптимизированных параметрах импульсного облучения с плотностью потока излучения 50 мВт/см2, длительностью импульса 200 мс и периодом повторения 800 мс, соотношением 1/4. Дальнейшее увеличение рабочего цикла до 1/16 не увеличивало цитотоксичность клеток in vitro. Было проведено сравнение фотодинамического цитотоксического эффекта на жизнеспособность клеток в клеточном монослое и сфероидах. IC50 (PDT) для монослоя клеток CT26 составляло около 2,5 Дж/см2 как в CW, так и в Pulse режимах. IC50 (PDT) для опухолевых сфероидов составил около 7,5 Дж/см2 в импульсном режиме и 20 Дж/см2 в непрерывном режиме. Данные проточной цитометрии, полученные для одноклеточной суспензии из сфероидов CT26 через 24 часа после ФДТ в непрерывном и импульсном режимах с использованием набора для обнаружения Аннексина V (маркер апоптоза), продемонстрировали увеличение доли Аннексин V-позитивных клеток с 43,1 % в непрерывном режиме до 93,4 % в импульсном режиме и значительное снижение доли живых клеток с 56,2 % в непрерывном режиме. режиме до 5,5% в импульсном режиме при 50 мВт/см2 и дозе облучения 15 Дж/см2.

Вывод

Использование оптимизированного импульсного режима ФДТ снизило среднюю скорость потока до 12,5 мВт/см2 и продемонстрировало большее подавление роста опухолевых сфероидов по сравнению с использованием непрерывного режима за счет повторной оксигенации и нормализованной эффективности ФДТ в области пролиферации клеток опухолевых сфероидов.



Работа выполнена в рамках государственного задания Комитета по здравоохранению Санкт-Петербурга для ГБУЗ «Санкт-Петербургский клинический научно-практический центр специализированных видов медицинской помощи (онкологический)»

Background

Photodynamic therapy (PDT) has a cytotoxic effect on tumor cells due to the generation of singlet oxygen. The depletion of molecular oxygen in the tumor tissue is the limiting factor for the antitumor effect of PDT throughout the entire thickness of the tissue. Three-dimensional tumor spheroids are good model of tumor tissue with limited oxygen supply. The purpose of this work was to determine the effect of laser irradiation parameters during PDT on the efficiency of growth inhibition of tumor spheroids.

Methods

The CT26 murine colon adenocarcinoma cell line was used. The cells were cultured in 5% CO2 incubator in RPMI-1640 culture medium supplemented with 10 % FBS and penicillin/streptomycin. 3D spheroids were generated by seeding of 1000 cells in 100 µl complete medium and cultured for 5 days in 96 well round bottom plates (96 well ULA plate, Corning, USA). Tumor spheroids with a diameter of 450-600 µm were incubated with the chlorine e6 photosensitizer at a concentration of 5 µg/ml in 200 mkl complete medium. PDT was performed 24 hours later using 662 nm laser ith continuous wave (CW) mode and pulsed irradiation (Pulse) mode at fluency rate 50 mW/cm2 with irradiation dose 5, 10, 15, 60 J/cm2.

Results

It was found that a decrease in the average power density from 50 mW/cm2 to 12.5 mW/cm2 during continuous PDT with an irradiation dose of 15 J/cm2 leads to an increase in the damage area of CT26 tumor spheroids in depth from 50-60 µm up to 160 µm. The experimental comparison of the Pulse and CW modes has showed that the maximum growth inhibition rate of CT26 tumor spheroids was observed for the optimized pulsed irradiation parameters with a fluence rate of 50 mW/cm2, pulse duration of 200 ms, and repetition period of 800 ms, ratio 1/4. A further increase in the duty cycle up to 1/16 did not increase the cell cytotoxicity either in vitro. The comparison of the photodynamic cytotoxic effect on cell viability in cell monolayer and 3D spheroid models was performed. IC50(PDT) for monolayer CT26 cells was about 2.5 J/cm2 for both CW and Pulse modes. IC50(PDT) for CT26 tumor spheroids was about 7.5 J/cm2 for Pulse mode and 20 J/cm2 for CW mode. Flow cytometry data obtained for single cell suspension of CT26 spheroids at 24h after PDT with CW and Pulse mode using Annexin V Detection kit have demonstrated the increasing of Annexiv V positive cells fraction from 43,1 % at CW mode to 93,4 % at Pulse mode and the significant reduction of live cells fraction from 56,2 % at CW mode to 5,5% at Pulse mode at 50 mW/cm2 and irradiation dose 15 J/cm2.

Conclusion

Using of the optimized Pulse mode PDT has reduced mean fluency rate to 12.5 mW/cm2 and demonstrated the greater suppression of CT26 tumor spheroids growth in compаre with using of CW mode due to re-oxygenation and normalized efficiency of PDT in the cell proliferating region of 3D spheroids.



This work was supported by the Health Committee of Saint Petersburg state assignment for Saint Petersburg Clinical Research and Practical Center of Specialized Types of Medical Care (Oncological).