Радиотерапия является одним из основных методов лечения онкологических заболеваний в современной врачебной практике и используется в качестве адъювантного, неоадъювантного или паллиативного средства в определенные моменты клинического течения болезни. При этом для терапии применяются различные варианты ионизирующих излучений, отличающихся природой излучения и/или подводимой мощностью дозы. Наиболее распространенным и классическим вариантом является лучевая терапия, однако, на сегодняшний день всё большую популярность набирают бета-эммитеры, входящие в состав таргетных радионуклидных препаратов, и характеризующихся низкой мощностью дозы. В свою очередь, большинство исследований проведено с использованием методов лучевой терапии с гамма и рентгеновскими источниками, а знания о механизмах действия корпускулярного бета-излучения разной интенсивности, отрывочны. Другим острым вопросом клинической радиобиологии является необходимость снижения общей дозовой нагрузки на организм и повышения чувствительности опухолевых клеток к проводимой радиотерапии. Одним из подходов к увеличению радиочувствительности опухолевых клеток является использование комбинированной терапии, с целью достижения аддитивных или синергических эффектов.

В целом, понимание механизмов действия ионизирующих излучений различной природы и мощности дозы, а также разработка подходов, направленных на увеличение эффективности терапии, являются значимыми задачами радиобиологии.

В работе использовали клеточную культуру эпидермоидной карциномы человека А431, поскольку в отношении карцином в клинической практике широко применяется метод радиотерапии.

Облучение проводили в двух режимах воздействия: высокой и низкой мощности дозы. Облучением в режиме высокой мощности дозы моделировали применяемую в клинике дистанционную лучевую или электронно-лучевую терапию и проводили с использованием линейного ускорителя Novalis Tx путем облучения клеток электронами или фотонами высоких энергий.

Облучением в режиме низкой мощности дозы моделировали контактную или радионуклидную терапию и в качестве источника использовали бета-эммиссионные закрытые препараты Sr-Y-90.

Облучение осуществляли в диапазонах от 4 до 80 Гр. Оценку жизнеспособности клеток после воздействия проводили методом МТТ-теста. Для анализа вклада цитотоксических и цитостатических эффектов проводили исследование механизмов клеточной гибели и анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла методом проточной цитофлуорометрии. Оценку проводили каждые 24 часа после облучения в течение трех циклов деления.

Мониторинг продукции активных форм кислорода в клетках после облучения осуществляли с использованием дихлордигидрофлуоресцеина диацетата H2DCF-DA, исследование проводили методом конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии.

В качестве радиосенсибилизирующих агентов были выбраны фотосенсибилизаторы хлориновой и порфириновой природы. Для комбинированной терапии использовали концентрации фотосенсибилизаторов и дозы облучения не превышающие IC50 и LD50. Облучение ионизирующим излучением проводили после обработки фотосенсибилизатором. Выраженность комбинированных эффектов определяли с использованием коэффициента синергии.

Показано, что процент жизнеспособных клеток зависит от времени прошедшего после облучения, что говорит о наличии цитостатических эффектов. Так процент жизнеспособных клеток значительно ниже при оценке через 72 часа после облучения. Через 24 часа снижение жизнеспособности клеток не превышает 20%. Процент жизнеспособных клеток после облучения в дозе 5 Гр высокой мощности дозы составил 50%. При облучении низкой мощности дозы 50% жизнеспособных клеток наблюдали после облучения в дозе 18 Гр. Таким образом, в обоих вариантах воздействия имеют место отсроченные эффекты действия радиации.

Одним из основных механизмов действия радиации является образование активных форм кислорода (АФК). При исследовании динамики образования АФК в опухолевых клетках после облучения нами было зарегистрировано увеличение концентрации АФК в клетках в 4 раза после воздействия дозами, близкими к полулетальным для каждого из режимов воздействия.

Анализ механизмов цитостатического действия радиации показал увеличение количества клеток, претерпевающих арест или радиационный блок митозов в фазе G2/M после облучения высокой мощностью дозы. В случае бета-излучения низкой мощности дозы подобной закономерности выявлено не было. При этом через 72 часа после воздействия зарегистрировали дозозависимое увеличение числа мёртвых клеток. Через 24 и 48 часов после воздействия количество мёртвых клеток было заметно ниже, что может быть связано с тем, что клеточная гибель наступает в процессе одного из первых четырёх пострадиационных митозов.

При проведении комбинированной терапии ионизирующим излучением и фотосенсибилизаторами хлориновой и порфириновой природы наблюдали значительное уменьшение количества жизнеспособных клеток в сравнении с монотерапиями. Нами были зарегистрированы аддитивные и синергические эффекты при комбинации фотодинамической и радиотерапии.

Таким образом, мы предполагаем, что проведенный сравнительный анализ механизмов действия ионизирующих излучений разной природы и мощности дозы, а также присутствие аддитивных и синергических эффектов при комбинации радиотерапии с фотосенсибилизаторами потенциально открывают путь к разработке новых, усовершенствованных протоколов проведения радиотерапии онкологических заболеваний.

Работа выполнена при поддержке Центра передового опыта «Центр фотоники» Министерства науки и высшего образования РФ No 075-15-2022-293.

Radiotherapy is one of the main methods of cancer treatment in modern medical practice and is used as an adjuvant, neoadjuvant or palliative agent at certain points in the clinical course of the disease. In this case, various variants of ionizing radiation are used for therapy, differing in the nature of the radiation and/or the dose rate delivered. The most common and classic option is radiation therapy, however, to date, beta-emitters, which are part of targeted radionuclide drugs, and are characterized by a low dose rate, are gaining more and more popularity. In turn, most of the studies were carried out using methods of radiation therapy with gamma and X-ray sources, and knowledge about the mechanisms of action of corpuscular beta radiation of different intensity is fragmentary. Another acute issue of clinical radiobiology is the need to reduce the total dose load on the body and increase the sensitivity of tumor cells to radiotherapy. One of the approaches to increase the radiosensitivity of tumor cells is the use of combination therapy in order to achieve additive or synergistic effects.

In general, understanding the mechanisms of action of ionizing radiation of various nature and dose rate, as well as the development of approaches aimed at increasing the effectiveness of therapy, are significant tasks of radiobiology.

We used a cell culture of human epidermoid carcinoma A431, since radiotherapy is widely used in clinical practice for carcinomas.

Irradiation was carried out in two exposure modes: high and low dose rate. Irradiation in the high dose rate mode simulated external beam or electron beam therapy used in the clinic and was carried out using a Novalis Tx linear accelerator by irradiating cells with high-energy electrons or photons.

Irradiation in the low dose rate mode was used to simulate contact or radionuclide therapy, and Sr-Y-90 beta-emission closed preparations were used as a source.

Irradiation was carried out in the range from 4 to 80 Gy. Cell viability after exposure was assessed using the MTT test. To analyze the contribution of cytotoxic and cytostatic effects, we studied the mechanisms of cell death and analyzed the distribution of cells by phases of the cell cycle by flow cytometry. The evaluation was performed every 24 hours after irradiation for three fission cycles.

The production of reactive oxygen species in cells after irradiation was monitored using dichlorodihydrofluorescein diacetate H2DCF-DA; the study was performed by confocal laser scanning fluorescence microscopy.

Photosensitizers of chlorin and porphyrin nature were chosen as radiosensitizing agents. For combination therapy, concentrations of photosensitizers and radiation doses not exceeding IC50 and LD50 were used. Irradiation with ionizing radiation was carried out after treatment with a photosensitizer. The severity of the combined effects was determined using the synergy coefficient.

It was shown that the percentage of viable cells depends on the time elapsed after irradiation, which indicates the presence of cytostatic effects. Thus, the percentage of viable cells is significantly lower when assessed 72 hours after irradiation. After 24 hours, the decrease in cell viability does not exceed 20%. The percentage of viable cells after irradiation at a dose of 5 Gy at a high dose rate was 50%. At low dose rate irradiation, 50% of viable cells were observed after irradiation at a dose of 18 Gy. Thus, in both variants of exposure, there are delayed effects of the action of radiation.

One of the main mechanisms of action of radiation is the formation of reactive oxygen species (ROS). When studying the dynamics of ROS generation in tumor cells after irradiation, we registered a 4-fold increase in ROS concentration in cells after exposure to doses close to semi-lethal for each of the exposure modes.

An analysis of the mechanisms of the cytostatic effect of radiation showed an increase in the number of cells undergoing arrest or radiation block of mitoses in the G2/M phase after high dose rate irradiation. In the case of low dose rate beta radiation, no such regularity was found. At the same time, 72 hours after exposure, a dose-dependent increase number of dead cells. At 24 and 48 hours after exposure, the number of dead cells was noticeably lower, which may be due to the fact that cell death occurs during one of the first four postradiation mitoses.

During combined therapy with ionizing radiation and photosensitizers of chlorin and porphyrin nature, a significant decrease in the number of viable cells was observed in comparison with monotherapies. We have registered additive and synergistic effects with a combination of photodynamic and radiotherapy.

Thus, we assume that the comparative analysis of the mechanisms of action of ionizing radiation of different nature and dose rate, as well as the presence of additive and synergistic effects in the combination of radiotherapy with photosensitizers, potentially opens the way to the development of new, improved protocols for radiotherapy of oncological diseases.

The work was supported by the Center for Excellence "Center for Photonics" of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation No. 075-15-2022-293.