Лучевая терапия (ЛТ) является широко используемым методом адъювантной терапии для различных видов рака, до 80% онкобольных получают лучевую терапию либо с лечебной, либо с паллиативной целью. Тем не менее, несмотря на успешное применение ЛТ при раке, у некоторых пациентов после завершения курса ЛТ все еще развиваются рецидивы. Хотя рецидив опухоли после ЛТ может быть связан с остаточным заболеванием или агрессивной биологией опухоли, он также может быть связан с выживанием популяции клеток, которые либо обладают большей внутренней устойчивостью к ЛТ (например, гипоксические или раковые стволовые клетки), либо развиваются de novo. Эти радиорезистентные клетки могут затем повторно заселить участок опухоли, что приведет к рецидиву и неэффективности лечения. Предыдущие исследования показали, что в развитии радиорезистентности участвуют многочисленные факторы, в том числе нарушение регуляции сигнальных путей, гиперпродукция онкогенных миРНК, реакции на повреждение ДНК, наличие раковых стволовых клеток и изменения метаболизма рака, а также влияние самого микроокружения опухоли (включая гипоксию). Многие исследования сосредоточены на изолированных путях при изучении радиорезистентности, но вполне вероятно, что эти пути взаимосвязаны, например, гипоксия может вызывать более недифференцированный клеточный фенотип, характеризующийся повышенной экспрессией маркеров стволовых клеток, что также может влиять на экспрессию генов и путей, контролирующих стволоподобность, таких как, например, факторы Яманаки. По сравнению с исследованием химиорезистентности, механизмы, лежащие в основе развития радиорезистентности, плохо изучены, отчасти из-за отсутствия модельных систем радиорезистентности. Требуется более глубокое понимание этих молекулярных механизмов, лежащих в основе приобретенной радиорезистентности, а главное, разработка стратегий, позволяющих обойти эту клиническую проблему. Использование глобальных подходов для изучения механизмов резистентности вызывает все больший интерес, поскольку это позволит одновременно изучать несколько путей и дает представление о сложных биологических системах и реакции на лечение.

В этом исследовании, мы разработали новые радиорезистентные клеточные линии, полученные путем фракционированного облучения из клеточной линии рака прямой кишки CT26-WT(ATCC-CRL2638). Родительская клеточная линия была выбрана исходя из того, что это простая и широко используемая животная модель колоректального рака. Существование доступной животной модели дает перспективы не только на генотипическую и фенотипическую характеристику полученных линий с целью поиска основных молекулярных путей, обуславливающих радиорезистентность, но и проведение функциональных исследований In vivo, которые могут позволить разработать более успешные терапевтические подходы для лечения пациентов с рецидивами, после предыдущего лечения с применением ЛТ. Для получения радиорезистентных линий нами были выбраны два режима фракционированного облучения с суммарной финальной поглощенной дозой 40 Грей(Гр), облучение проводилось на Гамма-установке для радиационных исследований РХ-γ-30. Первый включал в себя 20 фракций по 2Гр с мощностью дозы 0,95Гр/мин, облучение проводилось ежедневно, затем отбирался устойчивый клон(CT26-WT-RR2). Второй режим состоял из 4 раундов облучения дозой 10Гр и мощностью дозы 8,5Гр/мин, после чего отбирался выживший клон, который облучался в следующем раунде(CT26-WT-RR10). Во втором режиме, доза 10Гр за фракцию была выбрана исходя из того, что при облучении большими дозами, получить выживший клон из материнской линии у нас не получилось. Два подхода были выбраны с целью установить, приводит ли один из них к большей радиорезистентности, чем второй и является ли механизм приобретения резистентности универсальным.

Сравнительный анализ чувствительности полученных клеточных линий к воздействию ионизирующего излучения по отношению к материнской клеточной линии мы проводили методом оценки выживаемости и пролиферативной активности клеток всех трех линий после единоразового облучения линейкой доз от 2 до 10 Гр с шагом в 2Гр. Кривые роста клеток строили с помощью данных МТТ-теста и прямого измерения индекса роста клеток xCELLigence Real-Time Cell Analysis (Agilent Technologies, США). Полулетальная доза(ЛД50) оценивалась как доза, при которой через 10 дней после облучения, количество живых клеток в два раза меньше количества клеток той же линии, не подвергшихся облучению. ЛД50 для клеток линий CT26-WT, CT26-WT-RR2 и CT26-WT-RR10, составили, соответственно 2.4±0.4, 3.2±0.5 и 4.5±0.6 Грей. В результате применения обоих подходов, мы получили клеточные линии, которые отличаются повышенной радиорезистентностью по сравнению с материнской клеточной линией. Разные протоколы облучения, а именно варьирование количества фракций, дозы за фракцию и мощности дозы при сохранении суммарной поглощенной дозы неизменной, позволяют получить различающиеся по характеристикам клеточные линии.

Radiation therapy (RT) is a widely used adjuvant therapy for various types of cancer, with up to 80% of cancer patients receiving radiation therapy for either curative or palliative purposes. However, despite the success of RT in cancer, some patients still relapse after completion of RT. Although tumor recurrence after RT may be associated with residual disease or aggressive tumor biology, it may also be associated with the survival of a population of cells that are either more intrinsically resistant to RT (eg, hypoxic or cancer stem cells) or develop de novo. These radioresistant cells can then repopulate the tumor site, leading to recurrence and treatment failure. Previous studies have shown that multiple factors are involved in the development of radioresistance, including dysregulation of signaling pathways, overproduction of oncogenic miRNAs, DNA damage responses, the presence of cancer stem cells and changes in cancer metabolism, as well as the influence of the tumor microenvironment itself (including hypoxia). Many studies have focused on isolated pathways in studying radioresistance, but it is likely that these pathways are interrelated, for example, hypoxia may induce a more undifferentiated cellular phenotype characterized by increased expression of stem cell markers, which may also affect the expression of genes and stem-like pathways such as like the Yamanaka factors. Compared to chemoresistance research, the mechanisms underlying the development of radioresistance are poorly understood, partly due to the lack of radioresistance model systems. A deeper understanding of these molecular mechanisms underlying acquired radioresistance is required, and most importantly, the development of strategies to circumvent this clinical problem. The use of global approaches to study the mechanisms of resistance is of increasing interest, as it will allow the study of several pathways at the same time and provides insight into complex biological systems and response to treatment.

In this study, we developed novel radioresistant cell lines derived from fractionated irradiation from the CT26-WT(ATCC-CRL2638) colorectal cancer cell line. The parental cell line was chosen on the basis that it is a simple and widely used animal model of colorectal cancer. The existence of an available animal model offers promise not only for the genotypic and phenotypic characterization of the obtained lines in order to search for the main molecular pathways that cause radioresistance, but also for in vivo functional studies, which may allow the development of more successful therapeutic approaches for the treatment of patients with relapses, after previous treatment. using LT. To obtain radioresistant lines, we chose two modes of fractionated irradiation with a total final absorbed dose of 40 Gray (Gy); The first included 20 fractions of 2 Gy each with a dose rate of 0.95 Gy/min, irradiation was carried out daily, then a resistant clone (CT26-WT-RR2) was selected. The second regimen consisted of 4 rounds of irradiation with a dose of 10 Gy and a dose rate of 8.5 Gy/min, after which a surviving clone was selected, which was irradiated in the next round (CT26-WT-RR10). In the second mode, the dose of 10 Gy per fraction was chosen based on the fact that when irradiated with high doses, we did not succeed in obtaining a surviving clone from the maternal line. Two approaches were chosen to establish whether one of them leads to greater radioresistance than the second and whether the mechanism of resistance acquisition is universal.

We performed a comparative analysis of the sensitivity of the resulting cell lines to the effects of ionizing radiation with respect to the maternal cell line by assessing the survival and proliferative activity of cells of all three lines after a single irradiation with a dose range from 2 to 10 Gy with a step of 2 Gy. Cell growth curves were plotted using data from the MTT test and direct measurement of the cell growth index xCELLigence Real-Time Cell Analysis (Agilent Technologies, USA). The half-lethal dose (LD50) was estimated as the dose at which, 10 days after irradiation, the number of living cells is two times less than the number of cells of the same line that were not irradiated. LD50 for CT26-WT, CT26-WT-RR2, and CT26-WT-RR10 cell lines were 2.4±0.4, 3.2±0.5, and 4.5±0.6 Gy, respectively. As a result of both approaches, we have obtained cell lines that are characterized by increased radioresistance compared to the maternal cell line. Different irradiation protocols, namely, varying the number of fractions, dose per fraction, and dose rate while maintaining the total absorbed dose unchanged, make it possible to obtain cell lines with different characteristics.