Задача профилактики и терапии патологических состояний нервной системы, связанными с эксайтотоксическим и окислительным повреждением, будет оставаться актуальной в ближайшие десятилетия. Это обуславливает актуальность поиска эффективных средств фармакологической коррекции и предупреждения данных патологий. Целью настоящей работы являлось исследование нейропротекторной активности комената калия (КК) при эксайтотоксическом воздействии глутамата (Глу) в культурах нейронов мозжечка крыс.

Соединение коменат калия отличается тем, что входящие в его состав катион калия и анион коменовой кислоты сами по себе биологически активны. Основными функциями калия в организме являются: поддержание постоянства состава клеточной и межклеточной жидкости, кислотно-щелочного равновесия, обеспечение межклеточных контактов, биоэлектрической активности клеток, поддержание нервномышечной возбудимости [3]. Коменовая кислота (5-гидрокси-γ-пирон-2-карбоновая), имеет широкий спектр биологической активности: обладает антиоксидантным свойством, мягким седативным действием, антиабстинентным, анксиолитическим и антидепрессантным свойствами [4, 5]. Вышеназванные свойства катиона калия и аниона коменовой кислоты и послужили основанием для изучения нейропротекторных свойств КК.

В работе использован КК, синтезированный в отделе биологически активных веществ им. проф. А.Я. Шурыгина ФГБОУ ВПО «КубГУ» [1].

Культуры зернистых клеток мозжечка получали из мозга 7–9-дневных крысят линии Wistar методом ферментно-механической диссоциации как описано ранее [2]. Эксперименты проводили после 7 дней культивирования. Культуры обрабатывали 100 мкМ Глу в течение 10 минут. КК в концентрациях от 1 мМ до 0,001 мМ вносили в культуры после воздействия Глу. Через 4,5–5 часов культуры фиксировали ФУСом, окрашивали трипановым синим и учитывали число живых и погибших нейронов на микроскопе Invertoscopes ID 03.

Внутриклеточный уровень кальция оценивали с использованием Fluo4-AM на многофункциональном ридере FilterMax F5. Fluo4-AM вносили в культуры перед воздействием Глу на 30 минут. Регистрацию флуоресценции проводили при длине волны возбуждения 485 нм, эмиссии 535 нм. Результаты представлены в %, за 100% принят уровень флуоресценции контрольных культур, не подвергавшихся воздействию Глу и КК.

Антиокислительные свойства КК оценивали in vitro, в модельной системе ЦФЛ (цитратно-фосфатный буфер с люминолом). Образование активных форм кислорода (АФК) инициировали введением 35 мМ раствора сернокислого железа. Регистрацию хемилюминесценции осуществляли прибором SmartLum 5773 в течение 5 минут, оценивали светосумму. Влияние КК на генерацию АФК оценивали в сравнении с коменовой кислотой. Результаты рассчитывали в % от контроля, который принимали за 100%.

Для оценки достоверности различий выборок применяли t-критерий Стьюдента.

КК в отсутствие Глу независимо от концентрации не влиял на выживаемость нейронов. Воздействие Глу приводило к резкому снижению неповреждённых клеток до 29,6%. Внесение в культуры, обработанные Глу, КК приводила к повышению выживаемости при всех исследованных концентрациях (p<0,05). Наиболее высокая выживаемость нейронов в сравнении с Глу (на 35,9% больше) отмечалась при концентрации 0,1 мМ – доля неповреждённых нейронов составила 65%.

В экспериментах с Fluo4-AM воздействие Глу привело к возрастанию уровня кальция в нейронах до 187,3±3,7%. Добавление КК в концентрациях 1,0, 0,1 и 0,01 мМ в культуры, подвергнутые воздействию глутамата, существенно снизило уровень кальция: до 158,3±9,6%, 162,3±7,2% и 153,1±7,3%, соответственно. Воздействие КК на культуры, не подвергавшиеся действию глутамата, не оказало существенного влияния на уровень кальция в нейронах.

Результаты сравнительного исследования антиокислительных свойств КК и коменовой кислоты in vitro показали, что КК значительно снижает содержание свободных радикалов в модельной системе ЦФЛ. Уровень снижения свободных радикалов КК имеет дозозависимый эффект и практически не отличается от уровня гашения свободных радикалов коменовой кислотой: при 0,1 мг/мл – снижение на 65% и 69%, при 0,01 мг/мл – снижение на 34% и 33%, соответственно для КК и коменовой кислоты.

Таким образом, установлено, что применение КК на фоне глутаматной цитотоксичности способствует значительному снижению гибели нейронов мозжечка в культуре. Полагаем, что данный эффект опосредован антиоксидантной активностью КК, а также влиянием на ионный гомеостаз.

Работа выполнена при финансовой поддержке государственного задания ЮНЦ РАН № 122020100351-9.



Литература:

1. Антиоксидантное, стресс- и нейропротекторное фармакологическое средство-коменат калия Шурыгина Л.В., Злищева Э.И., Кравцов А.А. и др. Патент на изобретение RU 2514632 C1, 27.04.2014.

2. Козин С.В., Кравцов А.А., Елкина А.А. и др. Изотопное замещение дейтерия на протий в тканях головного мозга крыс изменяет его резистентность к гипоксии // Биофизика. 2019. Т. 64. № 2. С. 362-370.

3. Скальный А.В., Рудаков И.А. Биоэлементы в медицине. М. 2004. 272 с.

4. Шурыгин А.Я. Препарат бализ. Краснодар. 2002. 416 с.

5. Крылов Б.В., Щеголев Б.Ф. Патент РФ на изобретение № 2209062, МПК (7) A61K31/351, A61P25/20.

The problem of prevention and therapy of pathological conditions of the nervous system associated with excitotoxic and oxidative damage will remain relevant in the coming decades. This determines the relevance of the search for effective means of pharmacological correction and prevention of these pathologies. The aim of this work was to study the neuroprotective activity of potassium comenate (PK) under the excitotoxic effect of glutamate (Glu) in cultures of rat cerebellar neurons.

The potassium comenate compound is distinguished by the fact that the potassium cation and the comenic acid anion included in its composition are themselves biologically active. The main functions of potassium in the body are: maintaining the constancy of the composition of the cellular and intercellular fluid, acid-base balance, providing intercellular contacts, bioelectrical activity of cells, maintaining neuromuscular excitability [3]. Comenic acid (5-hydroxy-γ-pyrone-2-carboxylic acid) has a wide spectrum of biological activity: it has an antioxidant property, a mild sedative effect, anti-withdrawal, anxiolytic and antidepressant properties [4, 5]. The above properties of the potassium cation and the comenic acid anion served as the basis for studying the neuroprotective properties of PK.

In the work, we used PK synthesized in the Shurygin A.Ya. Department of Biologically Active Substances Kuban State University [1].

Cerebellar granular cell cultures were obtained from the brains of 7–9 day old Wistar rat pups by enzyme mechanical dissociation as described previously [2]. Experiments were performed after 7 days of cultivation. Cultures were treated with 100 μM Glu for 10 minutes. PK at concentrations from 1 mM to 0.001 mM was introduced into cultures after exposure to Glu. After 4.5–5 hours, the cultures were fixed, stained with trypan blue, and the number of living and dead neurons was counted using an Invertoscopes ID 03 microscope.

Intracellular calcium levels were assessed using Fluo4-AM on a FilterMax F5 multifunctional reader. Fluo4-AM was added to the cultures before Glu exposure for 30 minutes. Fluorescence was recorded at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 535 nm. The results are presented in %, the level of fluorescence of control cultures not exposed to Glu and PK was taken as 100%.

The antioxidant properties of PK were evaluated in vitro, in the CFL model system (citrate-phosphate buffer with luminol). The formation of reactive oxygen species (ROS) was initiated by introducing a 35 mM solution of iron sulfate. Registration of chemiluminescence was carried out with a SmartLum 5773 device for 5 minutes, the light sum was estimated. The effect of PK on ROS generation was evaluated in comparison with comenic acid. The results were calculated as % of the control, which was taken as 100%.

To assess the significance of differences between samples, Student's t-test was used.

CK in the absence of Glu, regardless of the concentration, did not affect the survival of neurons. The impact of Glu led to a sharp decrease in intact cells to 29.6%. The addition of KA to Glu-treated cultures resulted in increased survival at all concentrations tested (p<0.05). The highest survival of neurons in comparison with Glu (by 35.9% more) was observed at a concentration of 0.1 mM - the proportion of intact neurons was 65%.

In experiments with Fluo4-AM, exposure to Glu led to an increase in the level of calcium in neurons up to 187.3±3.7%. The addition of PK at concentrations of 1.0, 0.1 and 0.01 mM to cultures exposed to glutamate significantly reduced the level of calcium: to 158.3±9.6%, 162.3±7.2% and 153.1±7.3%, respectively. The impact of PK on cultures not exposed to glutamate did not significantly affect the level of calcium in neurons.

The results of a comparative study of the antioxidant properties of PK and comenic acid in vitro showed that PK significantly reduces the content of free radicals in the CFL model system. The level of reduction of free radicals PK has a dose-dependent effect and practically does not differ from the level of quenching of free radicals by comenic acid: at 0.1 mg / ml - a decrease by 65% and 69%, at 0.01 mg / ml - a decrease by 34% and 33 %, respectively for PK and comenic acid.

Thus, it was found that the use of PK against the background of glutamate cytotoxicity contributes to a significant decrease in the death of cerebellar neurons in culture. We guess that this effect is mediated by the antioxidant activity of PK, as well as the effect on ionic homeostasis.

The work was financially supported by the state order of the SSC RAS No. 122020100351-9.



Bibliography:

1. Antioxidant, stress- and neuroprotective pharmacological agent-potassium comenate Shurygina L.V., Zlishcheva E.I., Kravtsov A.A. et al. Patent RU 2514632 C1, 04/27/2014.

2. Kozin S.V., Kravtsov A.A., Elkina A.A. et al. Isotopic substitution of deuterium for protium in rat brain tissues changes its resistance to hypoxia // Biophysics. 2019. V. 64. No. 2. P. 362-370.

3. Skalny A.V., Rudakov I.A. Bioelements in medicine. M. 2004. 272 p.

4. Shurygin A.Ya. Baliz drug. Krasnodar. 2002. 416 p.

5. Krylov B.V., Shchegolev B.F. RF patent for invention No. 2209062, IPC (7) A61K31/351, A61P25/20.