Микроокружение опухоли в настоящее время рассматривается как один из важнейших факторов формирования фенотипа клеток, обеспечивающего их существование и пролиферацию в условиях гипоксии и дефицита питательных веществ, а также резистентность клеток к воздействию цитотоксических соединений. Поэтому в настоящее время все большую популярность приобретают трехмерные модели in vitro, более релевантные в отношении сложной структуры опухоли in vivo. Переход от 2D к 3D клеточным культурам требует модификации методов оценки роста опухоли, при этом подавляющее большинство используемых методов требуют разрушения структуры геля, что делает исследование дорогостоящим и трудоемким. Целью данной работы являлась разработка метода количественной оценки роста опухолевых клеток в коллагеновом гидрогеле с использованием флуоресцентного подхода и его апробация в исследовании ответа клеток на неблагоприятные условия культивирования и цитотоксическое воздействие.

В работе были использованы клетки карциномы яичника человека SKOVip-kat c геном красного флуоресцентного белка TurboFP635 и клетки эпидермоидной карциномы человека A431-GFP с геном флуоресцентного белка GFP. При создании 3D-культуры клеток использовали раствор коллагена I типа. Клетки были заключены в гидрогели, обогащенные питательной средой, путем смешивания клеточной суспензии с ингредиентами геля. Полученные гели инкубировали в течение 8-10 суток при 37°C и 5% CO2. Рост клеток контролировали путем прямого подсчета их количества после деструкции геля, а также путем анализа общего содержания ДНК в гелях. Помимо этого, нами предложен подход, основанный на регистрации интегральной флуоресценции гелей без их разрушения. Для этого ежедневно получали изображения гелей используя установку для поверхностного флуоресцентного имиджинга и производили обработку изображений с помощью программы ImageJ. Было проведено сравнение скорости роста культур опухолевых клеток в стандартных условиях, в условиях питательной депривации (культуральная среда без FBS или глюкозы) и гипоксии (1% О2). Кроме этого, был проанализирован ответ клеток на действие цисплатина и направленного противоопухолевого токсина DARPin-LoPE. Проведено сравнение ответа клеток на действие перечисленных факторов при их культивировании в коллагеновом гидрогеле и в монослойной культуре.

Предложенный подход, основанный на регистрации флуоресценции в реальном времени, показал хорошую согласованность с прямым подсчетом выделенных из гидрогеля клеток и измерением содержания ДНК в гелях. Преимуществом предложенного подхода является мониторинг роста культуры клеток в гидрогелях без их разрушения, что значительно снижает ресурсозатратность и трудоемкость исследования. Анализ влияния факторов микроокружения на 3D-модели с использованием флуоресцентной визуализации позволил оценить различия в чувствительности опухолевых клеток линий А431-GFP и SKOVip-kat к сывороточной, глюкозной и кислородной депривациям. При этом культура А431-GFP показала высокую устойчивость к недостатку сыворотки, однако продемонстрировала сильную чувствительность к глюкозной и кислородной депривациям. Линия клеток SKOVip-kat, напротив, оказалась высоко чувствительна к действию сывороточной депривации, при этом показала относительную нечувствительность к глюкозной и кислородной депривациям. С использованием предложенного подхода показано также, что культивирование в коллагеновом гидрогеле приводило к повышению устойчивости клеточных линий SKOV3.ip-kat и A431-GFP к цисплатину. В случае SKOV3.ip-kat повышение устойчивости произошло в 4 раза, в то время как в случае A431-GFP – более чем в 40 раз. Сравнительное исследование действия различных факторов на 2D- и 3D-моделях показало, что нахождение опухолевых клеток в коллагеновом геле также существенно модифицирует их чувствительность и может привести как к снижению, так и к увеличению устойчивости.

Таким образом, предложенный метод флуоресцентной визуализации может быть использован для мониторинга роста опухолевых клеток в коллагеновом гидрогеле в реальном времени, а также для регистрации ответа на неблагоприятные условия культивирования и действие противоопухолевых агентов. При этом данный метод позволяет значительно снизить стоимость исследований клеточной токсичности на 3D-моделях опухолевого роста.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-74-20168).

The tumor microenvironment is currently considered as one of the most important factors in the formation of the cell phenotype, which ensures their existence and proliferation under conditions of hypoxia and nutrient deficiency, as well as cell resistance to the effects of cytotoxic compounds. Therefore, three-dimensional in vitro models, which are more relevant to the complex structure of the tumor in vivo, are becoming increasingly popular. The transition from 2D to 3D cell cultures requires modification of methods for assessing tumor growth, while the vast majority of the methods used require the destruction of the gel structure, which makes the study expensive and time-consuming. The aim of this work was to develop a method for quantitative assessment of tumor cell growth in collagen hydrogel using a fluorescent approach and to test it in the study of cell response to unfavorable cultivation conditions and cytotoxic effects.

We used SKOVip-kat human ovarian carcinoma cells with the TurboFP635 red fluorescent protein gene and A431-GFP human epidermoid carcinoma cells with the GFP fluorescent protein gene. When creating a 3D cell culture, a solution of type I collagen was used. Cells were embedded in nutrient-enriched hydrogels by mixing the cell suspension with the ingredients of the gel. The resulting gels were incubated for 8-10 days at 37°C and 5% CO2. Cell growth was controlled by direct counting of their number after gel degradation, as well as by analysis of the total DNA content in the gels. In addition, we have proposed an approach based on the registration of the integral fluorescence of gels without their destruction. To do this, images of the gels were obtained daily using a surface fluorescence imaging setup and image processing was performed using the ImageJ program. The growth rate of tumor cell cultures was compared under standard conditions, under conditions of nutrient deprivation (culture medium without FBS or glucose) and hypoxia (1% O2). In addition, the response of cells to the action of cisplatin and the targeted antitumor toxin DARPin-LoPE was analyzed. A comparison was made of the response of cells to the action of the listed factors during their cultivation in collagen hydrogel and in a monolayer culture.

The proposed approach based on real-time fluorescence registration showed good agreement with direct counting of cells isolated from the hydrogel and measurement of the DNA content in the gels. The advantage of the proposed approach is the monitoring of cell culture growth in hydrogels without their destruction, which significantly reduces the resource consumption and labor intensity of the study. Analysis of the influence of microenvironmental factors on 3D models using fluorescence visualization made it possible to evaluate differences in the sensitivity of A431-GFP and SKOVip-kat tumor cells to serum, glucose, and oxygen deprivation. At the same time, the A431-GFP culture showed high resistance to serum deficiency, but showed a strong sensitivity to glucose and oxygen deprivation. The SKOVip-kat cell line, on the contrary, was highly sensitive to the action of serum deprivation, while showing relative insensitivity to glucose and oxygen deprivation. Using the proposed approach, it was also shown that culturing in collagen hydrogel led to an increase in the resistance of SKOV3.ip-kat and A431-GFP cell lines to cisplatin. In the case of SKOV3.ip-kat, the increase in resistance was 4-fold, while in the case of A431-GFP, it was more than 40-fold. A comparative study of the effect of various factors on 2D and 3D models showed that the presence of tumor cells in collagen gel also significantly modifies their sensitivity and can lead to both a decrease and an increase in resistance.

Thus, the proposed method of fluorescent imaging can be used to monitor the growth of tumor cells in collagen hydrogel in real time, as well as to record the response to unfavorable cultivation conditions and the action of antitumor agents. At the same time, this method can significantly reduce the cost of cell toxicity studies on 3D models of tumor growth.

This research was funded by the Russian Science Foundation (project No. 19-74-20168).