Разработка новых эффективных и безопасных нейропротекторов остается актуальной задачей в фармакологии. В отношении коменовой кислоты установлен антиоксидантный и нейропротекторный эффект, а хелидоновая кислота обладает выраженным противовоспалительным действием. В отношении меконовой кислоты нейропротекторное и антиоксидантное действие не было изучено. Целью настоящей работы было установление нейропротекторного и антиоксидантного потенциала меконовой кислоты в модельных системах.

Защитное действие меконовой кислоты на культуру нейронов мозжечка изучали на модели глутаматной токсичности и кислородо-глюкозной депривации (КГД) [1].Антиоксидантную активность меконовой кислоты изучали квантово-механическими расчетами в программном пакете ORCA 5.0.1 и экспериментально методом хемилюминесцентного анализа в модельных системах: цитрат-фосфат-люминол (ЦФЛ) и желточных-липопротеинов (ЖЛП)[2].Хелатирующие свойства меконовой кислоты по отношению к Fe3+ в растворах изучены Job's методом[3].Меконовая кислота(МК)была получена из койевой кислоты в отделе биологически активных веществ Кубанского государственного университета. Согласно расчетным данным, меконовая кислота обладает наименьшим значением энтальпии одноэлектронного переноса в трианионной форме и составляет 318,7 кДж/моль, тогда как для дианионой формы данное значение равно 421,3 кДж/моль. Рассчитанные значения энергии переноса электрона в водной фазе для МК соизмеримы с природными антиоксидантами ¬- катехинами, а экспериментально полученные значения ингибирования развития свободнорадикальных реакций в модельных системах выше, чем у этилметилгидроксипиридина сукцинат(ЭМГПС). В модельной системе ЦФЛ МК проявила дозозависимое снижение интенсивности свечения хемилюминесцентной реакции. При концентрации 0,2 мМ МК уменьшает хемилюминесценцию на 73 % против 48 % ЭМГПС. Снижение интегрального показателя свечения при концентрациях антиоксидантов 0,3 и 0,6 мМ составило 80 и 87% у МК против 55 и 73 % у ЭМГПС (p <0,05). МК и ЭМГПС оказали также дозозависимое снижение интенсивности развития свободнорадикальной реакции окисления липидов желтка в модельной системе желточных-липопротеинов.Полученные экспериментальные данные в двух модельных системах и расчетные данные указывают на высокий антиоксидантный потенциал МК. Было установлено, что МК оказывает защитный эффект на моделях ишемии in vitro. Ее действие приводит к снижению уровня внутриклеточного кальция и восстановлению мембранного потенциала митохондрий в культуре нейронов мозжечка при глутаматном воздействии, и увеличению процента живых клеток при кислородо-глюкозной депривации. При действии КГД в отсутствии МК количество живых клеток составило 12 %.Добавление МК в культуру нейронов мозжечка, подвергшихся КГД, способствовало увеличению выживаемости клеток. Статистически значимого отличия в количестве живых клеток между исследуемыми концентрациями не наблюдалось, однако, максимальный эффект наблюдался при концентрации 1мМ и составил 56 %, а минимальный при концентрации 0,001 мМ и составил 31 %. Десятиминутная инкубация глутамата приводила к 60% гибели нейронов мозжечка по сравнению с контролем, при этом добавление МК во всех концентрациях способствовало уменьшению гибели нейронов. Достоверного отличия в количестве живых клеток между исследуемыми концентрациями не было, однако наблюдалась такая тенденция, что максимальная концентрация МК 1 мМ оказывает наименьший эффект (55% живых клеток), тогда как при концентрации 0,01 и 0,001 мМ количество выживших клеток максимально и составило 65 %. Воздействие глутаматом приводило к возрастанию уровня цитозольного кальция на 69 % по отношению к контролю. С другой стороны, в культурах с добавлением МК повышение уровня кальция было существенно меньше и составило 38 %, 46 %, 46 %, 48 % к контролю, соответственно для концентраций 1; 0,1; 0,01 и 0,001 мМ. Действие возбуждающей аминокислоты на клетки головного мозга приводило к снижению мембранного потенциала митохондрий на 17 % по отношению к контролю. Меконовая кислота способствовала меньшему снижению значения мембранного потенциала митохондрий на 9 %, 8%, 7% и 10 % по сравнению с контролем для концентраций 1; 0,1; 0,01 и 0,001 мМ. Спектроскопические результаты исследований меконовой кислоты с Fe3+ показали, что при физиологическом значении pH преобладает комплекс с соотношением меконовая кислота/Fe3+ 3:1 в значении ~ 97% с высокой константой устойчивости, тогда как на долю комплекса составом 2:1 приходится ~ 3%. Эти данные позволяют говорить о возможном хелатировании ионов железа МК в тканях головного мозга и уменьшению интенсивности окислительных процессов за счет ингибирования реакции Фентона, и, как следствие, снижению повреждения и гибели нейронов.

Полученное антиоксидантное, хелатирующее и цитопротекторное действие меконовой кислоты дает основание для дальнейшего изучения возможных нейропротекторных свойств данного соединения в экспериментах in vivo, а полученные в работе данные о ее физико-химических свойствах могут быть полезны для синтеза и изучения новых координационных соединений на основе меконовой кислоты.

Работа выполнена при финансовой поддержке государственного задания ЮНЦ РАН № 122020100351-9.

Список литературы:

1. A. Kravtsov, S. Kozin et al. Reduction of Deuterium Level Supports Resistance of Neurons to Glucose Deprivation and Hypoxia: Study in Cultures of Neurons and on Animals // Molecules. – 2022. – Vol. 27. – No 1. – DOI 10.3390/molecules27010243.

2. Козин С. В., Кравцов А. А. и др. Цитопротективный и антиоксидантный эффект меконовой кислоты в модельных системах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2021. – Т. 171. – № 5. – С. 592-595. – DOI 10.47056/0365-9615-2021-171-5-592-595. – EDN WESBMK.

3. Козин С. В., Иващенко Л. И. и др. Меконовая кислота – возможный нейропротектор: обоснование на экспериментах in vitro и физико-химических свойствах // Биофизика. ¬¬– 2023. – Т.68. - №1. - С. 20-32.

The development of new effective and safe neuroprotectors remains an urgent task in pharmacology. With regard to comenic acid, an antioxidant and neuroprotective effect has been established, and chelidonic acid has a pronounced anti-inflammatory effect. With regard to meconic acid, the neuroprotective and antioxidant effects have not been studied. The aim of this work was to establish the neuroprotective and antioxidant potential of meconic acid in model systems.

The protective effect of meconic acid on the culture of cerebellar neurons was studied using the model of glutamate toxicity and oxygen–glucose deprivation (OGD)[1]. The antioxidant activity of meconic acid was studied by quantum mechanical calculations in the ORCA 5.0.1 software package and experimentally by chemiluminescent analysis in model systems: citrate-phosphate-luminol (CPL) and yolk lipoproteins (YLP)[2]. The chelating properties of meconic acid with respect to Fe3+ in solutions were studied by Job's method [3].Meconic acid (MA) was obtained from kojic acid in the Department of Biologically Active Substances of the Kuban State University.

According to the calculated data, meconic acid has the lowest value of the enthalpy of one-electron transfer in the trianionic form and is 318.7 kJ/mol, while for the dianion form this value is 421.3 kJ/mol. The calculated values of the electron transfer energy in the aqueous phase for MA are commensurate with the natural antioxidants β-catechins, and the experimentally obtained values of inhibition of the development of free radical reactions in model systems are higher than those of ethylmethylhydroxypyridine (EMHPS). In the model CPL system, MA showed a dose-dependent decrease in the intensity of the luminescence of the chemiluminescent reaction. At a concentration of 0.2 mM, MA reduces chemiluminescence by 73% versus 48% of EMHPS. The decrease in the integral luminescence index at antioxidant concentrations of 0.3 and 0.6 mM was 80 and 87% for MA versus 55 and 73% for EMHPS (p <0.05). MA and EMHPS also had a dose-dependent decrease in the intensity of development of the free radical reaction of yolk lipid oxidation in the model system of yolk-lipoproteins. The experimental data obtained in two model systems and the calculated data indicate a high antioxidant potential of MA. MA has been found to have a protective effect in in vitro models of ischemia. Its action leads to a decrease in the level of intracellular calcium and the restoration of the membrane potential of mitochondria in a culture of cerebellar neurons under glutamate exposure, and an increase in the percentage of living cells under OGD. Under the action of OGD in the absence of MA, the number of living cells was 12%.The addition of MA to the culture of cerebellar neurons subjected to OGD contributed to an increase in cell survival. There was no statistically significant difference in the number of living cells between the studied concentrations, however, the maximum effect was observed at a concentration of 1 mM and amounted to 56%, and the minimum effect was observed at a concentration of 0.001 mM and amounted to 31%. A ten-minute incubation of glutamate resulted in 60% death of cerebellar neurons compared with the control, while the addition of MA at all concentrations contributed to a decrease in neuronal death. There was no significant difference in the number of living cells between the studied concentrations, however, there was such a tendency that the maximum concentration of 1 mM MA had the least effect (55% of living cells), while at a concentration of 0.01 and 0.001 mM, the number of surviving cells was maximum and amounted to 65 %. Exposure to glutamate led to an increase in the level of cytosolic calcium by 69% relative to the control.On the other hand, in cultures with the addition of MA, the increase in the level of calcium was significantly less and amounted to 38%, 46%, 46%, 48% of the control, respectively, for concentrations 1; 0.1; 0.01 and 0.001 mM. The action of the excitatory amino acid on brain cells led to a decrease in the membrane potential of mitochondria by 17% relative to the control. MA contributed to a smaller decrease in the value of the membrane potential of mitochondria by 9%, 8%, 7% and 10% compared with the control for concentrations 1; 0.1; 0.01 and 0.001 mM. The spectroscopic results of studies of MA with Fe3+ showed that at physiological pH, the complex with a meconic acid/Fe3+ ratio of 3:1 of ~ 97% with a high stability constant prevails, while the complex with a composition of 2:1 accounts for ~ 3%. These data allow us to speak about the possible chelation of iron ions by MA in the brain tissues and a decrease in the intensity of oxidative processes due to the inhibition of the Fenton reaction,and,as a result, a decrease in damage and death of neurons.

The obtained antioxidant, chelating, and cytoprotective action of meconic acid provides a basis for further study of the possible neuroprotective properties of this compound in in vivo experiments, and the data obtained in the work on its physicochemical properties can be useful for the synthesis and study of new coordination compounds based on meconic acid.

Work with the financial support of the state assignment SSC RAS No. 122020100351-9

Bibliography:

1. A. Kravtsov,S. Kozin et al. Reduction of Deuterium Level Supports Resistance of Neurons to Glucose Deprivation and Hypoxia: Study in Cultures of Neurons and on Animals // Molecules.-2022.-Vol.27.-No 1.-DOI 10.3390/molecules27010243.

2. Kozin S. V.,Kravtsov A. A. et al. Cytoprotective and antioxidant effect of meconic acid in model systems // Bulletin of experimental biology and medicine. - 2021. - T. 171. - No. 5. - P. 592-595. – DOI 10.47056/0365-9615-2021-171-5-592-595. – EDN WESBMK.

3. Kozin S.V.,Ivashchenko L.I.et al.Meconic acid as a possible neuroprotector: substantiation on in vitro experiments and physicochemical properties // Biophysics. ¬¬– 2023. – V.68. - No. 1. - P. 20-32.