Среди повреждений ДНК, наиболее критичными для дальнейшей судьбы клетки являются двунитевые разрывы ДНК (ДР ДНК). В результате некорректной репарации ДР ДНК возникают микроструктурные аберрации хромосом, а также различные цитогенетические нарушения. При этом невозможность репарации ведет к активации механизмов клеточной гибели или старению клеток.

Образующиеся во время репарации ДР ДНК сложные динамические микроструктуры, состоящие из сотен и тысяч копий белков участвующих/ассоциированных с процессом репарации, визуализируются после иммуноцитохимического окрашивания в виде ярких точек, и называются фокусами белков репарации.

Фокусы репарации ДНК, наблюдаемые как через 24 часа, так и через большее время после облучения получили в литературе название остаточных. Полагают, что они представляют из себя сайты репарации сложных, потенциально летальных ДР ДНК. Известно, что увеличение количества остаточных фокусов связано со снижением колониеобразующей способности. Причиной снижения клоногенного роста и выживаемости является не только гибель клеток, но главным образом потеря способности клеток к размножению, в том числе из-за клеточного старения (cенесценции). Однако особенности их пострадиационных количественных изменений и роль в процессах клеточной гибели и старения, до сих пор изучены недостаточно.

Целью данной работы было изучение взаимосвязи между изменениями количества остаточных фокусов репарации ДНК ключевых белков, участвующих в клеточном ответе на возникновение ДР ДНК (γH2AX (сенсор), pATM (трансдуктор), 53BP1 (медиатор), р-p53 (эффектор)) и долей сенесцентных клеток в фибробластах человека через 24, 48 и 72 ч после воздействия рентгеновского излучения в дозах 1-10 Гр.

Результаты исследований показали, что по количественному выходу остаточных фокусов исследованные белки можно расположить в порядке убывания γH2AX > 53BP1 > pATM ≥ p-p53. C увеличением времени после облучения с 24 до 72 ч количество остаточных фокусов всех исследованных белков снижается. Это снижение можно объяснить несколькими параллельно идущими процессами: элиминацией высокоповрежденных клеток по механизмам апоптоза, аутофагии и т.д.; завершением процесса репарации ДНК и наконец снижением пролиферативной активности клеток, сопровождающееся уменьшением количества репликативных повреждений ДНК.

Воздействие рентгеновского излучения также приводило к дозозависимому увеличению доли стареющих SA-β-gal позитивных и покоящихся/стареющих Ki-67 негативных фибробластов. Облученные клетки в ответ на образование ДР ДНК активируют точки контроля клеточного цикла по ATM/ATR-сигнальному пути, обусловливая задержку или остановку клеточного цикла в определенных фазах клеточного цикла. При этом за повреждением ДНК и замедлением (остановкой) клеточного цикла не обязательно следует клеточное старение, так как не исключаются полная репарация или клеточная гибель. Между количеством остаточных фокусом и долей сенесцентных фибробластов в тот или иной исследованный интервал времени (24, 48 или 72 ч) после облучения отмечается положительная корреляционная зависимость. Однако если количество фокусов со временем после облучения уменьшается, то доля сенесцентных клеток, напротив увеличивается. По всей видимости сложные, трудные для процессов репарации ДНК повреждения запускают процесс радиационно-индуцированного старения, тогда как в сенесцентных клетках процесс репарации может продолжаться, что и ведет к снижению количества остаточных фокусов с увеличением количества времени после облучения, но увеличению доли сенесцентных клеток.

Работа была выполнена при поддержке гранта РНФ №22-2400490.

Among the DNA damages, the most critical for the further fate of the cell are DNA double-strand breaks (DSB). As a result of incorrect repair of DSB, microstructural aberrations of chromosomes occur, as well as various cytogenetic disorders. At the same time, the impossibility of repair leads to the activation of cell death or cellular senescence mechanisms.

Complex dynamic microstructures formed during DSB repair, consisting of hundreds and thousands of copies of proteins involved/associated with the repair process, are visualized after immunocytochemical staining in the form of bright dots, and are called DNA repair foci

DNA repair foci observed after 24 hours and later after irradiation are called residual in the literature. They are believed to be the repair sites for complex, potentially lethal DNA DSBs. It is known that an increase in the number of residual foci is associated with a decrease in colony-forming ability. The reason for the decrease in clonogenic growth and survival is not only cell death, but mainly the loss of the ability to divide due to cellular senescence.

However, the features of their post-radiation quantitative changes and their role in the processes of cell death and aging have not been sufficiently studied yet.

The aim of this work was to investigate the relationship between the changes in the number of residual DNA repair foci of key DDR (DNA damage response) proteins (yH2AX (sensor), pATM (transducer), 53BP1 (mediator), p-p53 (effector)) and the proportion of senescent cells in human fibroblasts 24, 48 and 72 hours after exposure to X-rays at doses of 1-10 Gy.

The results of the studies showed that according to the quantitative yield of residual foci, the studied proteins can be arranged in descending order yH2AX > 53BP1 > pATM ≥ p-p53. With an increase in the time after irradiation from 24 to 72 hours, the number of residual foci of all studied proteins decreases. This decrease can be explained by several parallel processes: the elimination of highly damaged cells by the mechanisms of apoptosis, autophagy, etc.; the completion of the DNA repair process and, finally, a decrease in the proliferative activity of cells, accompanied by a decrease in the amount of replicative DNA damage.

X-ray exposure also led to a dose-dependent increase in the proportion of SA-β-gal positive and Ki-67 negative fibroblasts. Irradiated cells, in response to the formation of DNA DSBs, activate cell cycle control points via the ATM/ATR signaling pathway, causing the delay or arrest of the cell cycle at certain phases. At the same time, DNA damage and slowing down (stopping) of the cell cycle are not necessarily followed by cell aging, since complete repair or cell death is not excluded.

It was also shown that there is a positive correlation between the number of residual foci and the proportion of senescent fibroblasts after irradiation in one or another studied time interval (24, 48 or 72 hours). However, if the number of foci decreases with time after irradiation, then the proportion of senescent cells, on the contrary, increases. Apparently complex, difficult to DNA repair damage triggers the process of radiation-induced aging, while in senescent cells the repair process can continue, leading to a decrease in the number of residual foci with time after irradiation, but to an increase in the proportion of senescent cells.

The work was carried out with the financial support of the RNF grant No. 22-2400490.